TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA
VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH
Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

NGUYỄN THỊ THU HẰNG
ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Năm 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

i
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn!!!
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

ii

TÓM TẮT
Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng
thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan nuôi thâm
canh ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả cho thấy vi khuẩn E.
ictaluri xuất hiện hầu hết ở các vùng nuôi. Kết quả phân lập từ mẫu cá đã xác
định được 84 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella. Qua kiểm tra các chỉ
tiêu cơ bản như nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase chọn ra 10 chủng
để tiến hành định danh theo phương pháp truyền thống và kit API 20E được cả
10 chủng đều là E. ictaluri. Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối
với một số chỉ tiêu (citrate, indole).
Kết quả chạy PCR một lần nữa khẳng định cả 10 chủng vi khuẩn đều là E.
ictaluri khi tất cả đều hiện vạch sáng ở 407 bp.
Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri với 8 loại
thuốc kháng sinh. Kết quả là 100% vi khuẩn kháng hoàn toàn với S
(streptomycin) và OA (oxolinic acid), 100% vi khuẩn kháng với FFC
(florfenicol), vi khuẩn nhạy nhất với AMX (amoxycillin). Riêng với DO
(doxycycline) có 80% số chủng nhạy, 10% số chủng trung bình nhạy và 10%
số chủng kháng. Nhìn chung trong tất cả 10 chủng thì chỉ có chủng CA4.4G
đa kháng với cả S, OA, FFC và DO.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên kháng sinh streptomycin đối với 2 chủng
vi khuẩn đã phân lập ở trên, kết quả cho thấy vi khuẩn E. ictaluri kháng với
streptomycin ở mức thấp (2-4 µg/ml).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iii


iv
3.3.3 Tách ròng mẻ cấy 14
3.3.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14
3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E 14
3.3.6 Phương pháp PCR 14
3.3.7 Phương pháp lập kháng sinh đồ 16
3.3.8 Phương pháp xác định MIC 16
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 17
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 18
4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 18
4.1.2 Kết quả định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 18
4.1.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E 20
4.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR 22
4.3 Kết quả kháng sinh đồ 23
4.4 Kết quả MIC 25
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 27
5.1 Kết luận 27
5.2 Đề xuất 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
PHỤ LỤC 33

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

v
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui
trình phát hiện vi khuẩn E. ictaluri 15
Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của các

PHẦN I
GIỚI THIỆU
Đồng Bằng Sông Cửu Long là một trong 7 vùng kinh tế trọng điểm nằm ở
phía Nam của đất nước, có diện tích gần 4 triệu ha, chiếm khoảng 12% tổng
diện tích cả nước. Đây là vùng hạ lưu châu thổ sông Mekong, được xem là
vùng trù phú nhất, không chỉ của Việt Nam mà của cả khu vực Đông Nam Á.
Đồng thời đây cũng là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất của cả nước, diện
tích nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 60% với sản lượng chiếm khoảng 65%
và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm 51% (Dương Nhựt Long, 2003). Mười
tháng đầu năm 2008, xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá
3.828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm
2007. Trong đó mặt hàng chủ lực là cá tra và cá basa đạt mức tăng trưởng cao
nhất (
Để đạt được những kết quả như thế đòi hỏi sự gia tăng cả về số lượng lẫn chất
lượng của sản phẩm vì vậy diện tích cũng như mật độ nuôi ngày càng được
nâng cao, kết quả là những năm gần đây, tình hình bệnh xuất hiện trên động
vật thủy sản ngày càng nhiều đã đến mức báo động. Một trong số những bệnh
đang được quan tâm hàng đầu đó là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ
về kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Ngày nay bệnh mủ gan vẫn đang là mối quan
tâm hàng đầu cho những ai đang và sẽ nuôi cá tra thâm canh ở khu vực
ĐBSCL. Theo Hawke (1981), Từ Thanh Dung (2004) cho rằng vi khuẩn E.
ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que, phản
ứng âm tính với oxidase và dương tính với catalase, không có khả năng sinh
H
2
S và Indole. Trên môi trường TSA ở 28
o
C sau 48 giờ vi khuẩn phát triển
thành những khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng, có rìa không đồng nhất.
Nhiều nghiên cứu trước đây đã xác định tác nhân gây bệnh mủ gan là do vi

Tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
Phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra.
Định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống và
phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).
Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri với một số loại thuốc kháng sinh.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

3
PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nuôi cá tra
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), trước đây còn có tên là Pangasius
hypophthalmus, P. micronemus hay P. Sutchi (Nguyễn Văn Kiểm, 2004), là
loài cá được nuôi hầu hết ở các nước Đông Nam Á và là loài cá nuôi quan
trọng nhất trong khu vực này. Ở Campuchia, sản lượng nuôi cá tra chiếm bằng
một nửa sản lượng các loài cá nuôi, trong đó tỷ lệ cá tra chiếm 98% trong 3
loài thuộc họ cá tra, chỉ có 2% là cá basa và cá vồ đém. Tại Thái Lan, nước
đầu tiên thành công trong việc sinh sản nhân tạo cá tra vào năm 1966 có sản
lượng cá tra nuôi chỉ đứng sau cá rô phi, đến năm 1970 đã chủ động cung cấp
giống cho nghề nuôi cá tra trong nước.
Cá tra là một loài cá nuôi truyền thống trong ao của nông dân các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Ngoài tự nhiên, cá tra phân bố ở lưu vực
sông MeKong, có mặt ở cả 4 nước: Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan
(Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Cá sống đựơc ở mọi tầng nước, thường sống được
ở các thủy vực nước tĩnh, nước chảy, chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt
của môi trường. Cá sống chủ yếu ở môi trường nước ngọt tuy nhiên cá vẫn có
thể sống và phát triển ở môi trường nước lợ (ao nuôi tôm sú vào mùa mưa).

Qua thống kê của Lê Xuân Sinh (2006) cho thấy bệnh mủ gan trên cá tra xuất
hiện nhiều nhất (82,1%), bệnh xuất huyết (63,4%), bệnh do ký sinh trùng
(32,0%). Ngoài ra, còn có một số bệnh nguy hiểm khác nhưng xuất hiện với
tần số thấp hơn như: bệnh vàng da (12,2%), bệnh đường ruột (11,5%), bệnh
lồi mắt (11,4%), bệnh tuột nhớt (10,0%), bệnh lở loét (3,1%),…
Gần đây, theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) cho thấy bệnh gan
thận mủ xuất hiện với tần số cao nhất (93,8%), tiếp theo đó là bệnh xuất huyết
(75%), bệnh trắng gan trắng mang (68,8%). Như vậy, thấy rằng bệnh gan thận
mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang là mối đe dọa lớn nhất cho
người nuôi cá tra hiện nay.
2.3 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.3.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới
Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập lần đầu tiên trên cá
nheo Mỹ (Ictalurus puntatus) bởi Hawke (1979) với tên gọi là ESC (Enteric
Septicaemia of Catfish).
Vi khuẩn E. ictaluri kén chọn vật chủ nhạy cảm hơn nhiều so với E. tarda và
gây thiệt hại đáng kể trên cá trơn. Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra được
tìm thấy ở loài Ictalurus punctatus (Hawke, 1979) còn có hai loài khác như
Ictalurus purcatus và Ictalurus catus (Plumb and Sanchez, 1983), Clarias
batrachus (Kasornchandra et al., 1987) ở Thái Lan.
Năm 1985, Boonyaratpalin cũng đã phát hiện E. ictaluri gây bệnh trên cá trê
trắng (Clarias batrachus) và trong môi trường nước ở Thái Lan (Trích dẫn bởi
Từ Thanh Dung, 2004)
Ngoài ra, mầm bệnh này cũng được công bố ở hầu hết Bắc Mỹ và các tiểu
bang khác như Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico (Inglis et
al., 1994). Năm 1976, Hawke đã phân lập được vi khuẩn E. ictaluri trên cá
nheo sông nâu (Ictalurus nebulosus). Bên cạnh đó vi khuẩn E. ictaluri còn
được báo cáo trên cá dao xanh (Eigemannia virens) (Kent & Lyons, 1982), cá
nheo xanh (Ictalurus furcatus) (Plumb & Sanchez, 1983), cá trê trắng (Clarias
batrachus) (Kasornchandra, 1987). Vi khuẩn này cũng được Crumlish (2001)

phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ (huyện Thốt Nốt, Phụng
Hiệp) và sau đó lan dần ra các tỉnh lân cận như Trà Vinh, Bến tre, Vĩnh Long,
Tiền Giang, (Từ Thanh Dung, 2004).
Bệnh gây ảnh hưởng đáng kể trên cá tra ở giai đoạn cá giống và cá lứa với tỉ
lệ chết rất cao (60-80%) và nó còn kéo dài đến giai đoạn cá thịt với tỷ lệ chết
thấp hơn (Lê Thị Bé Năm, 2002).
Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) đã tiến hành thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng
đến bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở ĐBSCL đã đưa ra
kết luận rằng mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả
năng nhiễm bệnh mủ gan trên cá tra. Khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn là 1,5
x 10
2
và 1,5 x 10
3
CFU/ml thì tỉ lệ chết dao động từ 56,6-56,7%.
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) ở Việt Nam, bệnh mủ gan chủ yếu xuất
hiện trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển). Thỉnh thoảng xuất hiện trên
cá basa. Tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn
nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500 g.
Bệnh mủ gan xuất hiện phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ. Ở Việt Nam, nhiệt
độ nước dao động từ 26-28
o
C (Trương Quốc Phú, 2004) là điều kiện thích hợp
cho vi khuẩn mủ gan phát triển. Sự thay đổi của môi trường và nguồn nước ô
nhiễm có ảnh hưởng lớn đến tần số xuất hiện của bệnh. Thường đến mùa lũ
nước mang nhiều phù sa, chất lượng nước thay đổi làm sức khỏe cá giảm dẫn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

6
đến sức đề kháng của chúng kém tạo điều kiện cho mầm bệnh dễ dàng xâm

2
S âm tính, di động yếu ở 25-30
o
C nhưng không di động ở
những nhiệt độ cao hơn. Loài vi khuẩn này phát triển tốt ở 28
o
C sau 24-48 giờ
tạo thành những khuẩn lạc có kích thước rất nhỏ.
Vi khuẩn E. ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18-28
o
C.
(Plumb, 1999). Do đó bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn rơi vào
mùa có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa
xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu, khi nhiệt độ nước khoảng 18-
28
o
C (Plumb, 1999). Trong điều kiện thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá nheo
giống thì ở 25
o
C cho tỉ lệ cá chết cao nhất, thấp nhất ở các nghiệm thức có
nhiệt độ 23
o
C và 28
o
C, không có cá chết ở các nhiệt độ 17
o
C, 21
o
C và 32
o

không tìm thấy bệnh trên cá basa. Nguyên nhân được Ferguson et al., (2001)
cho rằng đó là kết quả của sự khác biệt về tính nhạy cảm của loài.
Vi khuẩn E. ictaluri còn gây bệnh trên một số loài cá trong điều kiện thí
nghiệm như Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha và Rainbow trout
Oncarhynchus mykiss (Baxa et al., 1990)
Theo Cedric và Zilong (2003) cũng phân lập vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra
nuôi bè ở Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan
Theo Plumb (1999), khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên
môi trường TSA sau 48 giờ ở 28
o
C hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng
đục. Môi trường đặc trưng là EIA (Edwardsiella ictaluri agar).
Tuy nhiên, theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri
phân lập từ cá tra có một số đặc điểm khác so với mô tả của Plumb (1993) như
có dạng que và kích thước biến đổi, phát triển tốt ở 28
o
C và phát triển yếu ở
37
o
C. Dựa vào đó ta có thể giải thích tại sao vi khuẩn E. ictaluri cho tới nay
chỉ phát hiện trên cá mà chưa tìm được trên bất kỳ một loài động vật máu
nóng nào khác như chim, gia súc, heo, hay động vật hữu nhủ ở biển.
2.5 Tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản
Theo Gesamp (2001) thì thuốc hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản bao
gồm các loại liên quan đến vật tư công trình, xử lý đất và nước, tác nhân
kháng khuẩn, thuốc trị bệnh, thuốc trừ sâu, thuốc gây tê và hormon.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

8
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp, có nguồn gốc sinh học hay

sulphonamides. Vì vậy không nên dùng những loại thuốc này để điều trị bệnh
mủ gan.
Hawke (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã làm kháng sinh đồ trên 10 chủng vi
khuẩn E. ictaluri. Sau đó, Shotts and Waltman (1986) kiểm tra sự kháng thuốc
trên 118 E. ictaluri phân lập được ở Hoa Kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh.
Kết quả nghiên cứu cho thấy đa số vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các
loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với
colistin và sulfamids. Reger et al.,(1993) cùng xác định các chủng E. ictaluri
ở Hoa Kỳ đều nhạy với enrofloxacin, gentamicine và doxycycline. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

9
2.6 Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự
DNA chuyên biệt trong ống nghiệm một đoạn DNA với sự hiện diện của một
hoặc hai đoạn mồi (Oligonucleotides), enzym tổng hợp DNA, các nucleotide
tự do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được phát
minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự (Mỹ) vào tháng 10 năm 1985. Đây
là một kỹ thuật rất nhạy bén và đặc biệt, cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm
chí chỉ với một tiểu phân vi rút. Những vi rút ẩn, không có các biến đổi về mô
học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này. Hiện nay, kỹ thuật này được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như để phát hiện và tạo ra đột
biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh,…(Khuất Hữu Thanh,
2006)
Theo Trần Linh Phước (2003) thì PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu
kỳ lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ 3 bước là:
- Bước 1: (bước biến tính - denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở

khuôn không sạch có lẫn các protein, hiệu quả PCR giảm theo tỉ lệ thuận với
độ tinh sạch của DNA khuôn.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

10
Enzym DNA polymerase càng mạnh thì phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các
đặc tính của enzym DNA polymerase mà hiệu quả phản ứng khác nhau.
Mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Chọn
mồi cần tính toán để đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh
lệch nhau quá lớn, các mồi phải có trình tự nucleotide để chỉ có thể bắt cặp bổ
sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp giữa khuôn PCR không
thành công. Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại.
Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự giữa hai mồi không lớn quá 1 kb.
Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20-200
µM/mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp giảm hiệu quả PCR, ngược lại
nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự khuếch đại "kí sinh".
Nồng độ Mg
++
, MgCl
2
cũng ảnh hưởng, cần đảm bảo các thành phần dung
dịch đệm, nhiệt độ và các chất cần thiết khi thực hiện phản ứng PCR. Sự mất
cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của
polymerase.
Ngoài ra, theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998) thì phản ứng PCR còn bị ảnh
hưởng bởi số lượng chu kỳ của phản ứng PCR, thông thường không vượt quá
40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Bên cạnh đó, thiết bị và dụng cụ cho phản
ứng PCR cũng góp phần ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng.
2.6.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR
Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) thì phương pháp PCR có các ưu

florfenicol trên E. tarda, Aeromonas hydrophyla, Pseudomonas fluorescens,
Vibrio cholerae và Salmonella spp, kết quả là các loài vi khuẩn này đã kháng
với florfenicol. Điều này được các nhà khoa học giải thích rằng trước đây ở
Thái Lan đã sử dụng choloramphenicol cho nên các dòng vi khuẩn này đã
kháng thuốc, florfenicol cũng là thành phần của choloramphenicol nên các
dòng vi khuẩn này vẫn kháng với florfenicol.
Năm 2007, Nguyễn Thị Tiên đã nghiên cứu và xác định giá trị MIC của
chloramphenicol trên một số loài vi khuẩn Virio gây bệnh phân trắng trên tôm
sú là 2-256 µg/ml.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

12
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01/2009 đến tháng 06/2009
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Mỹ Xương (Đồng Tháp), Chánh An (Vĩnh Long) và
Thốt Nốt (Cần Thơ).
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra có dấu hiệu bệnh mủ gan.
3.2 Vật liệu nghiên cứu

O
2
, giấy test oxidase,
VP, Nitrate, Citrate, Decarboxylase với các acid amin (Arginine, Lysine và
Ornithine), các loại đường (mannitol, sucrose, glucose, arabinose, inositol,
sorbitol, rhamnose) cùng các loại dụng cụ và hóa chất cần thiết khác.
Các hoá chất cần thiết cho phản ứng PCR
- NB (Nutrient broth)
- TE (pH 8.0) gồm 10 mM Tris HCl và 1 mM EDTA.
- Hoá chất dùng trong khuếch đại DNA: Buffer 10X, MgCl
2
, dNTPs (10
mM), Taq polymerase (5U), mồi, nước cất 2 lần.
- Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy điện di TAE
(Tris HCl: acetate: EDTA)
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu mẫu
Thu 4 cá bệnh và 2 cá khoẻ cho mỗi ao. Dùng vợt vớt cá hoặc dùng chày để
bắt cá và chứa trong thùng mốp (có sục khí). Nếu cá bị chết thì phải đóng gói
riêng từng con và trữ trong thùng đá chuyển về phòng thí nghiệm khoa Thủy
Sản-Đại học Cần Thơ để phân tích mẫu.
3.3.2 Phương pháp lấy mẫu vi sinh
Theo bài thực hành bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản (Từ Thanh Dung và
Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006).
Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cơ thể cá, dùng giấy lau sạch chất nhầy
trên cá. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng. Khi giải phẩu, để tránh các tạp
khuẩn bên ngoài thì các dụng cụ sử dụng phải được tiệt trùng bằng đèn cồn và
để nguội trước khi lấy mẫu ở các cơ quan. Dùng kéo tiệt trùng mổ cá (tránh
làm vỡ các cơ quan nội tạng), kiểm tra đầy đủ các cơ quan nội tạng, ghi nhận
tất cả các hiện tượng không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như: màu

định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993).
Cách tiến hành, thành phần hóa chất và môi trường cũng như cách pha chế
được trình bày trong Phụ lục 1.
3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E
Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux)
Các bước chuẩn bị và thực hiện (Phụ lục 2)
3.3.6 Phương pháp PCR
Chiết tách Acid nucleic (Bartie et al, 2006)
- Nuôi tăng sinh vi khuẩn (48 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường
NB.
- Chuyển 1,5 ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và cho vào 100 µl
dung dịch TE (10 mM Tris HCl và 1 mM EDTA).
- Ủ ở 95
o
C trong vòng 15 phút.
- Làm lạnh nhanh ống eppendorf trong nước đá.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch. Đo hàm lượng
DNA bằng máy so màu quang phổ (Biomate 5) ở 260nm.
- Xác định hàm lượng DNA:
Hàm lượng DNA (ng/µl) = A
260nm
x 50 x độ pha loãng
Khuếch đại AND (theo Panangala et al., (2007) có chỉnh sửa bởi Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv, 2008)
- Thành phần cho phản ứng
Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

15
Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC

25

- Chu kỳ nhiệt
1. Giai đoạn tiền biến tính: 95
o
C trong 4 phút
2. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm:
- Giai đoạn biến tính: 95
o
C trong 30 giây
- Giai đoạn gắn mồi: 55
o
C trong 45 giây
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72
o
C trong 30 giây
3. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72
o
C trong 10 phút
Điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa
1,5% agarose. Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung
dịch nguội khoảng 50-60
o
C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào
khay. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel
chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá
0,8 cm. EtBr được chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10 mg/ml. Pha loãng 10 mg/ml
nguyên liệu gốc 20.000 lần.
Điện di

Kháng sinh Kháng (mm) Trung bình nhạy (mm) Nhạy (mm)
AMX-25µg ≤13 14-17 ≥18
FFC-30µg ≤16 17-19 ≥20
NOR-10µg ≤12 13-16 ≥17
CS-50µg ≤8 9-10 ≥11
CIP-5µg ≤15 16-20 ≥21
S-10µg ≤11 12-14 ≥15
DO
-
30µg

≤12

13
-
15

≥16

OA-2µg ≤14 - ≥15
3.3.8 Phương pháp xác định MIC
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên
phương pháp pha loãng môi trường loãng (Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI). 2006).
Các bước tiến hành như sau
Chuẩn bị môi trường và hoá chất
Vi khuẩn được lấy từ tủ -80
o
C sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường
TSA, ủ trong tủ ấm 28

8
CFU/ml) rồi pha loãng xuống 1000
lần để mật độ vi khuẩn còn khoảng 1x10
5
CFU/ml. Sau đó, mỗi chủng vi
khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi
khuẩn và được ủ trong điều kiện với các ống MIC.
Cho 2ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 2ml dung dịch
thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2; ; 512 µg/ml (lắc đều)
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
Đối chứng âm: (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý)
Đối chứng dương: (2ml dung dịch vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý)
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28
o
C, trong 48 giờ (đến khi thấy vi khuẩn
trong đối chứng dương phát triển).
Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả
hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì
làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng âm và
dương.
Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng
sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển.
3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Microsoft Word được sử dụng để đánh văn bản và Microsoft exell được dùng
để vẽ biểu đồ và xử lý số liệu.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version