Chiến lợc sử dụng kháng thể để định tỷ lệ
phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền

Trần Khiên Hùng
Phòng Miễn dịch tế bào, Viện Pasteur tp Hồ Chí Minh

Nghiờn cu nhm xõy dng cho Labo min dch mt chin lc dựng khỏng th nh
t l % TCD
4
, % TCD
8
mt cỏch chớnh xỏc v r tin. Mu ca 38 ngi c chia thnh 2
nhúm: nhúm cú mu bỡnh thng: thy rừ 3 nhúm t bo lympho, mono, bch cu ht trờn
ca s FSC, SSC. V nhúm cú mu bt thng: khụng thy rừ 3 nhúm t bo nh trờn.
Hai b khỏng th c s dng:
Vi phng phỏp 4 mu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) v vi
phng phỏp 3 mu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP).
Giỏ tr % TCD
4
, %TCD8 ca tng mu c ghi nhn c 2 phng phỏp.
Dựng phn mm Excell xỏc nh h s tng quan c 2 phng phỏp ca cỏc mu
nghiờn cu.
Kt qu:
+ Trong nhúm t bo bỡnh thng h s tng quan gia PP 4 mu v PP 3 mu i
vi:
* TCD
4
: r = 0.96.
* TCD
8
: r = 0.87.

iu tr bng thuc hay nhng liu phỏp
khỏc nh th no? [1].
+ i vi bnh nhõn ghộp c quan thỡ
vic theo dừi nh k cỏc t l ny giỳp ta
d bỏo n tỡnh trng thi ghộp [2]
Trong thc t lm c vic ny,
chỳng ta cú nhiu chn la khỏc nhau v
cỏch thc x lý mu, loi khỏng th s
dng, cỏch thc phõn tớch , tuy nhiờn
trong phm vi nghiờn cu ny chỳng tụi tp
51
trung vào việc lựa chọn kháng thể để làm
xét nghiệm.
Với 2 loại kháng thể sau tương ứng với
phương pháp 4 màu, 3 màu.
+ CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45
(PerCP)/CD4 (APC) {4 màu}
+ CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP) {3
màu}
Thì độ chính xác của thử nghiệm và giá
cả cũng khác nhau.
Loại đầu tiên giá cho mỗi mẫu thử là
19.12 USD (theo khuyến cáo xử dụng của
hãng- báo giá ngày 21- 05- 2002) và nó
chính xác hơn loại kế tiếp nếu được kết
hợp với phương pháp phân tích đúng…(1)
Loại thứ hai thì giá tiền cho m
ỗi mẫu thử
chỉ có 6.44 USD nhưng kém tin cậy hơn.
Mục đích nghiên cứu là nhằm đưa ra được

B. C.

Hình 1: Nhóm bình thường và nhóm bất thường.
A. Nhóm bình thường thấy rõ 3 nhóm
dân số lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa
sổ FSC, SSC.
B. Nhóm quần thể bất thường không thể
xác định chính xác vị trí các nhóm.
C. Cũng là mẫu của nhóm quần thể bất
thường nhưng được ủ với loại kháng thể 4
màu và dùng cách xử lý khác. Nên sau đó
cũng phân biệt các nhóm quần thể tế bào
như ở hình 1- A.
2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu:
+Xử lý mẫ
u:
*1 ml máu tươi chống đông bằng EDTA
được xử lý trong vòng 4 giờ.
52
*Với PP 4 màu: ủ 5 µl kháng thể CD3
(FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
với 100 µl máu toàn phần.
*Với PP 3 màu: ủ 9 µl kháng thể (3 µl
cho mỗi loại) CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8
(PerCP) với 100 µl máu toàn phần.
*Hồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch
ly.
*Trung hòa bằng 1ml dung dịch PBS.
*Ly tâm 2000 rpm/1’ trong vòng 4 phút.
Bỏ dịch nổi, thêm vào 500 µl dung dịch

R
UL U
R
L
R
LYMPH
O
A.
B.
C.
D.

Hình 2: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 4 màu.
53
A. Dùng cửa sổ (x=SSC, y=Fl3:CD45)
giới hạn bạch cầu trong khu vực R1. Loại
trừ tất cả những yếu tố gây nhiễu như hồng
cầu, xác tế bào… ra khỏi khu vực phân
tích.
B. Cửa sổ (x=FSC, y=SSC) bắt nguồn
từ vùng R1. Thấy rõ 3 nhóm dân số và giới
hạn vùng lympho trong khu vực R2.
C. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl2:CD8) bắt
nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được
quần thể T CD8 ( CD3+, CD8+) và phối
hợp vớ
i phần mềm thống kê. Biết được tỷ
lệ % T CD8 trong vùng UR của cửa sổ.
D. Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl4:CD4) bắt
nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được

mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD
4

trong vùng UR của cửa sổ.
C. Cửa sổ (x=fl2:CD3, fl3:CD8) bắt
nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể
TCD
8
(CD3+, CD8+) và phối hợp với phần
mềm thống kê. Biết được tỷ lệ % TCD
8
trong vùng UR của cửa sổ.
D. Giới thiệu kết quả truy xuất của phần
mềm thống kê. % gated của vùng UR là
phần chúng ta quan tâm. Mỗi một cửa sổ
sẽ có một kết quả truy xuất thích hợp.
54
3. Phng phỏp thng kờ:
+ Giỏ tr % TCD
4
, TCD
8
ca tng mu
c ghi nhn c 2 phng phỏp 3, 4
mu.
+ i tng nghiờn cu c chia
thnh 2 nhúm:
*Nhúm bỡnh thng (hỡnh 1- A).
*Nhúm bt thng (hỡnh 1- B).
+Dựng phn mm Excell xỏc nh h

dõn s dng tớnh (cú CD4 b mt t
bo). Trỏi li vi qun th T CD8 li l qun
th liờn tc, khú thy ranh gii gia 2 nhúm
dõn s õm v dng. Vỡ th trong phõn tớch
i vi dõn s TCD
8
, chỳng ta khú loi tr
ht nhng tớn hiu nhiu do ú s cú sai s
gia 2 phng phỏp [1].
Cũn trong nhúm bt thng thỡ s
tng quan kộm hn nhiu.
Hm ý rng chỳng ta cú th s dng
phng phỏp 3 mu nh t l % TCD
4
,
T CD8 vi chớnh xỏc khụng kộm gỡ i
vi phng phỏp 4 mu v iu ny ch
gii hn trong nhúm dõn s bỡnh thng.
Mt yu t rt quan trng, theo thng kờ
ca chỳng tụi ti vin Pasteur TP.HCM t
4- 2002 n 2- 2003. Cú khong 1581
trng hp lm % TCD
4
, %TCD
8
, trong ú
ch cú 8 trng hp bt thng (vi t l
tng ng < 0.51%, mt t l rt thp). Bt
thng cú ngha l hng cu khụng ly gii
hon ton, cũn nhiu mnh v t bo

Đầu tiên chỉ cần dùng phơng pháp 3 mầu
với bộ kháng thể CD4/CD3/CD8. Nếu có tế
bào bất thờng mới chuyển sang phơng
pháp 4 màu với bộ kháng thể
CD3/CD8/CD45/CD4. Tỷ lệ đối tợng có tế
bào bất thờng của chúng tôi thấp
(<0,51%).
TI LIU THAM KHO
1.Marilyn A Owens, Michael R Loken.
Principles for clinical laboratory practice.
Wiley- Liss. 73- 108.
55
2.Carl A Burtis, Edward R Ashwood; Tietz
Textbook of Clinical Chemistry, Part 3;
W B Saunders Company; p1338.
Summary
The strategy use antibodies for quantity the
percentage of lympho TCD
4
, TCD
8
accurately and
low- cost
The samples were obtained from the 38 peoples that can be divided in two groups:
+ Normal samples group: can see clearly three populations (lymphocyte, monocyte,
granulocyte) on the window SSC, FSC.
+ Abnormal samples group: can’t difference those populations.
There are two types of antibodies used for each method.
+ 4 colors method: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC).
+ 3 colors method: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP).