Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ

278
ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG
KỲ (Astragalus radix) LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU
MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)
Đặng Thị Hoàng Oanh
1
và Trần Thị Yến Nhi
1ABSTRACT
Striped catfish (20-30 g/individual) were fed by pellet supplemented with 0,5%
extract from Astragalus radix for 5 weeks. Samples were colleted every week to
measure growth and subjeted to haematological analysis. After 5 weeks
feeding with herb extract, challenge experiment with Edwardiella ictaluri was
carried out by using immersion method. Results from haematological analysis
revealed a significant increase in total number red blood cells, lymphocyte,
monocyte, neutrophils and thrombocyte in fish that were fed 5 weeks with
extract. Where as, the total of white blood cells increased after three weeks.
After challenge with bacteria, number of red and white blood cells, lymphocyte
and thrombocyte decreased but monocyte and neutrophils increased. The
ability to kill bacteria in serum of diseased fish was higher than in healthy fish.
Percentage of bacteria survived after react with serum from fish fed with herb
extract was lower than that of fish fed without herb extract.
Keywords: striped catfish, Edwardsiella ictaluri, Astragalus radix extract.
Title: Effects of extracted product from Astragalus radix on non-specific
immune parameters of the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)
TÓM TẮT

mật độ cao là dịch bệnh dễ có điều kiện bùng phát và lây lan. Trong số các
bệnh thường gặp trên cá tra thì bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
là tác nhân nguy hiểm, gây thiệt hại nghiêm trọng lên đàn cá ở nhiều địa
phương vào giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ
chết cao (10-90%) (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Để hạn chế dịch bệnh người nuôi đã sử dụng rất nhiều loại kháng sinh. Việc
dùng kháng sinh trị bệnh thường tốn kém và hiệu quả không cao. Hơn nữa,
lượng tồn dư kháng sinh không chỉ
ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà
còn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Việc lạm dụng kháng sinh và
thuốc thú y thủy sản đang làm cho sản phẩm cá tra và basa của Việt Nam gặp
nhiều bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường khó tính (Bùi Quang Tề, 2006).
Trong các nỗ lực làm hạn chế dịch bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá tra, biện pháp
tăng cường sức đề kháng cho cá nuôi đang đượ
c nhiều người quan tâm. Phòng
bệnh cho cá tra bằng cách bổ sung các chất kích thích làm tăng sức đề kháng
vào thức ăn, sử dụng vắc-xin, thảo dược, các chất chiết xuất thảo dược để tăng
cường hoạt động của hệ thống miễn dịch là một hướng đi tích cực nhằm đảm
bảo sự phát triển bền v󱠐󳬁󻜁󺜁󽬅󲰁󻜍ề nuôi cá tra vùng ĐBSCL.
Hiện nay, một số nghiên cứ
u về việc bổ sung vitamin C vào thức ăn cho cá,
phòng bệnh cá tra bằng vắc-xin… đã được nghiên cứu và từng bước đưa vào
thực tế sản xuất. Nhưng đối với việc sử dụng thảo dược, các chất chiết xuất
thảo dược phòng bệnh mủ gan cho cá tra Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu
nhiều. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu về “Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây
hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá tra” nhằm tìm
hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây hoàng kỳ để làm tăng sự đề kháng của
cá tra nhiễm vi khuẩn E. ictaluri.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ


Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Chọn khuẩn lạc đồng nhất trong mẻ cất thuần để nuôi
tăng sinh trong môi trường BHI ở 28ºC trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn được
chuyển qua ống Falcon đã tiệt trùng, li tâm ở 8.000 vòng/phút trong 5 phút với
nhiệt độ 4ºC. Loại bỏ dung dịch phía trên, rửa phần còn lại (vi khuẩn) qua nước
muối sinh lý 2-3 lần, hòa tan nước muối và vi khuẩn. Pha loãng mật độ vi
khuẩn đến mật độ khoảng 10
4
CFU/ml. Mật số vi khuẩn được kiểm tra lại trên
môi trường TSA, kết quả mật độ vi khuẩn đã sử dụng là 0,42.10
4
CFU/ml.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ

281
2.2.2 Gây cảm nhiễm
Sau 5 tuần thực hiện thí nghiệm cho cá ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, thí
nghiệm cảm nhiễm cá với vi khuẩn E. ictaluri được thực hiện bằng phương
pháp ngâm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần gồm có: NT1:
không gây cảm nhiễm; NT2: không gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn bổ
sung hoàng kỳ; NT3: gây cảm nhiễm, cá sử dụ
ng thức ăn không bổ sung hoàng
kỳ và NT4: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn bổ sung hoàng kỳ 0,5%. Cá
được theo dõi dấu hiệu bệnh lý sau khi gây cảm nhiễm. Sau 1 tuần cảm nhiễm,
tiến hành thu mẫu máu phân tích các chi tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu),
xác định khả năng diệt khuẩn huyết thanh (3 cá/bể) và tái định danh vi khuẩn
E. ictaluri từ cá lờ đờ bằng cách trữ mô thận trong Ethanol (100%) để phân tích
PCR.
2.3 Phương pháp phân tích mẫu máu cá
Cá từ các bể thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm được thu ngẫu nhiên 3
con/bể. Máu được lấy ở động mạch chủ ở đuôi (Houston, 1990) và mỗi con cá

2.3.4 Từng loại bạch cầu (Hrubec & ctv, 2000)
Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm
3
) =
(số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/200.
2.3.5 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh
Lượng máu trữ trong tuýp nhựa 1,5 ml sau khi đem về phòng thí nghiệm được
ly tâm với tốc độ 1.300 vòng trong 4 phút. Rút lấy phần huyết thanh (dịch
trong) bên trên cho vào 1 tuýp nhựa khác (đã thanh trùng) và trữ ở -80°C cho
đến khi phân tích. Pha loãng huyết thanh 10 lần trong nước muối sinh lý khi sử
dụng. Cho 100 µl dung dịch huyết thanh vào các giếng trừ giếng đối chứng thì
cho môi trường nutrient broth (NB) vào. Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 48h
trong môi trường NB ở 28°C và pha loãng đến mật độ 10
4
CFU/ml. 30 µl vi
khuẩn được cho vào các giếng trừ giếng đối chứng. Ủ qua đêm ở 28°C. Sau đó
cho 10 µl MTT (5 mg/ml nước cất) vào các giếng, lắc trong 15 giây thì đọc ở
bước sóng 600 nm bằng máy microplate reader. Phần trăm vi khuẩn sống sót
được tính bằng công thức:
PSA = ((OD
sample
– OD
blank
)/(OD
control
– OD
blank
)) x 100
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.

158,48 ± 20,8
b

Lympho 98,50 ± 5,3
a
118,98 ± 14,9
b

Bạch cầu đơn nhân 6,16 ± 1,7
a
8,05 ± 2,4
b

Bạch cầu trung tính 7,55 ± 1,9
a
11,13 ± 2,4
b

Tiểu cầu 14,01 ± 1,8
a
17,67 ± 1,0
b

Giá trị thể hiện trên bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng 1 hàng có các
chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Sau 3 tuần cho ăn hoàng kỳ, tổng bạch cầu của cá ăn hoàng kỳ cao hơn có ý
nghĩa thống kê so với cá không ăn hoàng kỳ. Nhìn chung, số lượng tổng bạch
cầu của cá sử dụng hoàng kỳ tăng dần qua các tuần và cao hơn cá ở nghiệm
thức không cho ăn. Tương tự, các loại tế bào như lympho, bạch cầu đơn nhân,
bạch cầu trung tính, tiểu cầu tăng không ổn định qua 5 tuần và có sự khác biệt

hoạt động lysozyme sau 1 tuần, nâng cao hoạt động thực bào sau 3 tuần cho ăn.
3.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học
của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
3.2.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá được gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
Cá sau khi gây cảm nhiễm có dấu hiệu lờ đờ, đôi khi có xuất huyết. Khi giải
phẫu cá lờ đờ ghi nhận có đốm trắng ở thận, tỳ tạng và gan. Kết quả định danh
bằng phương pháp PCR cho thấy cá nhiễm vi khuẩn E. ictaluri.
3.2.2 Hồng cầu

Hình 2. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi số lượng hồng cầu cá sau cảm nhiễm. 1: cá
cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ; 2: cá cảm nhiễm ăn hoàng kỳ; 3: cá không
cảm nhiễm, không ăn hoàng kỳ; 4: cá không cảm nhiễm, ăn hoàng kỳ
Kết quả phân tích cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) rõ rệt về
số lượng hồng cầu của cá ở nghiệm thức cảm nhiễm E. ictaluri và không ăn
hoàng kỳ với cá ở nghiệm thức không gây cảm nhiễm E. ictaluri và không cho
ăn hoàng kỳ hoặc có cho ăn hoàng kỳ. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ

285
nghĩa giữa các nghiệm thức còn lại (Hình 2). Cá được gây cảm nhiễm có cho
ăn hoàng kỳ có số lượng hồng cầu giảm còn 87,6% so với cá không được gây
cảm nhiễm và không cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ trong khi cá được
gây cảm nhiễm không cho ăn hoàng kỳ thì số lượng hồng cầu giảm (chỉ còn
77,2%).
Giữa 2 nghiệm thức gây cảm nhiễm thì số lượng hồng cầu của cá ở nghiệm
thứ
c cá có sử dụng hoàng kỳ là 1,65x10
6
tế bào/ml, cao hơn cá ở nghiệm không
sử dụng hoàng kỳ là 1,45x10

Lympho
38,60 ± 9,1
a
73,88 ± 30,1
ab
97,72±7,0
b
113,52 ±12,6
b

Bạch cầu đơn nhân
6,93 ± 1,8
a
8,46 ± 4,4
a
5,41 ± 3,0
a
6,34 ± 1,7
a

Bạch cầu trung tính
8,16 ± 1,6
a
8,59 ± 5,6
a
7,68 ± 2,0
a
7,85 ± 2,6
a


Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002), vùng gan, thận, tỳ tạng cá nhiễm E. ictaluri
đến giai đoạn hoại tử thận bị mất chức năng quan trọng như bài tiết các chất
thải của quá trình trao đổi chất gây ra sự tích tụ các sản phẩm thải của quá trình
biến dưỡng gây độc cho cơ thể. Đồng thời, mô tạo máu cho cơ thể bị phá hoại
làm cho lượng máu trong cơ thể giảm do không có máu thay thế. Sự hoại tử ở
tỳ tạng cũng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già
cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu để bảo vệ cơ thể
chống lại vi khuẩn và những tác nhân gây bệnh khác. Đây chính là nguyên
nhân làm cho số lượng hồng cầu và tổng bạch cầu đều giảm. Số lượng tiểu cầu
cũng giảm nhanh khi có sự xuất hiện của vi khuẩn trong các tổ chức. Trong
máu và dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải một hàng rào rất quan trọng trong cơ
chế bảo vệ không đặc hiệu đó là các tế bào thực bào gồm có bạch cầu trung
tính và các đại thực bào (Vũ Triệu An, 2001), do đó khi bị vi khuẩn tấn công,
hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá hoạt động làm cho số lượng các tế bào này
tăng. Ainsworth và Dexiang (1990) đã chỉ ra rằng các bạch cầu trung tính cũng
quan trọng trong việc chống vi khuẩn gây bệnh trong đó có E. ictaluri. Bạch
cầu trung tính thực bào vi khuẩn Aeromonas hydrophila hay Micrococcus
luteus dễ dàng hơn so với E. ictaluri.
3.3 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh
Sáu mẫu huyết thanh của từng nghiệm thức được chọn ngẫu nhiên để tiến hành
đo khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. Kết quả tính phần trăm vi khuẩn sống
sót sau khi tương tác với huyết thanh được thể hiện ở bảng 3 cho thấy có
48,81% vi khuẩn còn sống sau khi tương tác với huyết thanh cá được gây cảm
nhiễm không có ăn hoàng kỳ; 31,25% vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với
huyết thanh cá được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ; 73,26% vi khuẩn còn
sống sau khi tương tác với huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm không
ăn hoàng kỳ và 66,68% vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá
không được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ.
Theo Lawrence et al,. (2003), khả năng kháng huyết thanh của vi khuẩn khác
nhau tuỳ theo cấu tạo lớp vỏ ngoài của vi khuẩn, kết quả nghiên cứu cho th

nhiễm cao hơn cá không được gây cảm nhiễm, cá ăn hoàng kỳ cao hơn cá
không ăn hoàng kỳ. Kết quả làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm sử
dụng chiết xuất từ cây hoàng kỳ để phòng bệnh do vi khuẩn ở cá tra.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ainsworth, A.J., Dexiang, C. (1990). Differences in the phagocytosis of four
bacteria by channel catfish neutrophils. Dev. Comp. Immunol. 14: 201.
Ardó L, Guojun Yin, Pao Xu, László Váradi, Gábor Szigeti, Zsigmond Jeney,
Galina Jeney, 2008. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera
Mẫu I II ĐC HK
1 132,71 29,64 126,68 174,18 106,21
2 67,04 59,6 89,69 78,28 136,07
3 132,95 90,56 127,13 102,68 166,4
4 30,57 42,56 56,83 6,59 101,94
5 124,64 90,12 81,61 55,07 -
6 109,26 32,86 77,27 8,57 -
Trung bình 48,81±18,79
a
31.25±2,28
ab
73,26±23,23
b
66,68±16,41
ab

Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ

288
japonica) and boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila.