TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DƯƠNG HẢI TOÀN
NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE
GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ
VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus)
GIAI ĐOẠN GIỐNG
vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn
tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii
ABSTRACT
“Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in
the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented
from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes
of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment
included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours,
each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in
brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the
treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish
(2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb).
Keywords: Malachite Green, biomarker, residue.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iv
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHƯƠNG 1 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 2 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
CHƯƠNG 4 17
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm
Malachite Green 17
4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 19
4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green 20
4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green 21
4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green 22
4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 23
4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 23
4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 25
4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra
trong quá trình thí nghiệm 26
4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)
trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 27
4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 28
CHƯƠNG 5 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
5.1 Kết luận 30
5.2 Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC 34
qua các đợt thu mẫu 25
Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 26
Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 27
Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 28 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vii DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 20
Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 22
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
viii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
LMG Leucomalachite green
MG Malachite Green
AchE Acethylcholine
LPO lipid peroxidase
GST Glutathione S-transferase
trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao.
Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra
của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam
được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm
2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài
cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục
thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển
rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ
thả nuôi tăng (120-130 con/m
3
trong nuôi bè và 25-35con /m
2
trong nuôi ao đất
(Nguyễn Chính, 2005).
Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày
đặc, cho thức ăn thừa dẫn đến môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra dẫn
đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là
vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị
Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng
như là Malachite Green.
Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên
ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một
loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá
giống. Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình
chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay
Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì sự tồn lưu này ảnh
hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada,
Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê
xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện
nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra việc sử dụng
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN
2.1.1 Sơ lược về Malachite green
Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane. MG là một loại bột
rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng
trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu MG được
xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên
sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS0
4
) mà còn gọi
[ ]
Công thức phân tử : C
23
H
25
N
2
.CL
Một số tên thường gọi:
• Malachite green chloride
• C.i. Basic green 4
• Benzaldehyde green
• n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene-
1- ylidene) -n-methyl-chloride
• Acryl brilliant green
• Aniline green
• Aizen malachite green
2.1.3 Độc tính Malachite green.
Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu
đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn
đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào
lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng
mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim
Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
Kết quả thí nghiệm xác định LC
50
của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus
punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC
50
Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an
toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo
chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG
trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử
dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản.
2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN
2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới
Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước
tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để
gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho
thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục,
trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu
hiệu.
Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh
vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được
sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại
chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net).
Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các
trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày từ 15/9/2005
đến 3/10/2005, Cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã
tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là
lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này. Lượng
hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6
2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam.
Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện
nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy
sản Việt Nam. Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa
100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002).
Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh
trùng cho thấy (vietlinh.com.vn):
Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb
Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
7
Sau 3 tháng : MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn
còn.
Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc tích lủy
MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào
mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong
thịt. Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng
sau khi ăn cá bị nhiễm.
2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase
(LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S-
transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).
Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn
truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961)
Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong cơ thể thường
góp phân vào các tiến trình phát sinh bệnh. Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự
hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid
hydroperoxides (LOOPs). LOOPs tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-
hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000)
Từ nghiên cứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ thấp 10.6 - 32.0 ng/l
Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của
Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme
Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu.
Theo Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia
tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con),
Weiss ( 1958) nghiên cứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và thấy rằng mức
độ hoạt hóa của AchE trong não bị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc. Ở nồng độ
500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huyết tương của cá bị
ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 80-
90% múc bình thường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình thường sau 35 ngày
(Silva và ctv 1993).
Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003). Thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan
lên hoạt động AchE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius). Thí
nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96
giờ và 1 tuần ở nồng độ 1.0 µg/l (dựa vào LC
50
của endosulfan đối với cá bluegill
sunfish là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AchE trong não giảm tương
ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.
J. Zhang và ctv (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol
(DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40
ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt
dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng.
Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC-
RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus.
Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL
-1
sau 24 giờ. Kết
quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL
-1
thì LPO trong não có sự
thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan,
não giảm ở nồng độ 0,5µgL
-1
và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.
0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút.
Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1
ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm.
Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng
khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước.
- Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước
- Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước.
3.2.2 Cá thí nghiệm
Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu sắc sáng,
khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật .
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10
3.2.3 Bố trí thí nghiện
Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được
lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức
có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít
nước, mỗi bể bố trí 50 con.
Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian
12 giờ.
Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1
giờ.
Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green.
3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu
Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục.
Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là
giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi
phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích
Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng
và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6. Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg.
88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với
đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb.
3.2.5 Chuẩn bị mẫu
Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá
Cân trọng lượng mẫu (A)
Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
50mM (pH=7.5)
(1:5 w/v)
Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B)
Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) Mẫu phân tích LPO(C)
Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4
o
C) Trữ -80
o
DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800
Sodium phosphate 150 100
Mẫu / 50
Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50
Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5
phút
Công thức tính
Abs * pha loãng
R =
(thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml)
R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein
0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate.
Lipid peroxidation
Nguyên tắc
LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance
(TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ
sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5%
và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15
phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần
nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm
mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang
phổ.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13
Chuẩn bị đường chuẩn: sử dụng malondialdehyde (MDA) làm đường chuẩn và
chuẩn bị như sau:
Bảng 3: Cách chuẩn bị đường chuẩn MDA
Nồng độ MDA Thể tích pha loãng
Dung dịch chuẩn 500µM
1 100µM 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14
Bảng 4: Quá trình phân tích GST
Hóa chất (µl) Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)
HEPES 700 700
CDNB ( nồng độ cuối 1.5mM ) 30 30
H
2
O 240 220
GSH 30 30
Mẫu / 20
Công thức tính:
Hoạt tính của GST = (A
340/min
– A
blank
) x độ pha loãng x coff.ExMol
CDNBcoeff = 9.6mM
-1
cm
-1
9.6mM
-1
cm
-1
hệ số CDNB chuyển thành CDNB – GS + HCl dưới tác dụng của
GST
Đơn vị tính của GST là nmol/mg protein/phút
chỉnh mẫu
Mẫu
G6PDH mix (µl) 600 600 600
H
2
O (µl) 400 390 360
Mẫu (µl) / 10 10
G6P (µl) / 30
Hoạt tính G6PDH được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 340 nm trong
3 phút.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
15
Cách tính:
A
OD
( A
OD Test
-A
OD blank
) x tổng thể tích(ml)x hệ số pha loãng
6.22 x 1.0 x thể tích mẫu (ml)
Đơn vị tính của G6PD là nmol NADPH/phút/mg protein
Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần, pha loãng mẫu bằng
dung dịch đệm potasium phosphate 50mM
Catalase (CAT)
Nguyên tắc :
Catalse là enzyme hiện diện trong peroxisom của hầu hết các tế bào hiếu khí và có
chức năng bảo vệ tế bào chống lại độc chất hydrogen peroxide bằng việc phân huỷ
H
2
C. Sau đó, 750µl of TiOSO
4
được thêm vào
để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đo ở 420 nm bằng máy so màu quang phổ. Một
đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra sự phân huỷ 90% cơ chất
trong một phút.
Quá trình phân tích:
Bảng 6: Quá trình phân tích CAT
Hoá chất
Mẫu (µl) Mẫu trắng 1 (µl) Mẫu trắng 2 (µl)
SC 1250 / /
BC / 1250 1250
Triton X- 100 25 25 25
Phosphate buffer 12.5 25 12.5
Mẫu 12.5 / /
Ủ mẫu trong 6 phút ở O
o
C
TiSO4 750 750 750
Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút
Đơn vị tính hoạt tính CAT là U/mgprotein.
Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần
Ho
ạt tính của G6PD
=
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16
Cách tính CAT(U/mg protein)= logSC-log(hấpthụ)*V
O
Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin
Hóa chất
Đường chuẩn Mẫu
0 mg
protein
0.05 mg
protein
0.1mg
protein
0.2 mg
protein
0.5 mg
protein
BSA 0µl 5 µl 10 µl 20 µl 50 µl /
Mẫu / / / / / 10
H
2
O 500 µl 495 µl 490 µl 480 µl 450 µl 490 µl
NaOH 1N 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
Ủ trong 30 – 120 phút
Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
Ủ trong 15 phút
Folin 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
Ủ trong 30 phút
Đọc ở bước sóng 660nm
Hoạt tính protein được đọc ở bước sóng 660nm bằng máy so mày quang phổ. Đơn
vị tính của protein là mg protein/ml
29,5±0,22
0,1 ppm 28,7±0,20
29,8±0,28
29,2±0,06
30,3±0,00
29,4±0,25
1 ppm 29,1±0,07
30,4±0,41
29,8±0,06
30,2±0,06
29,6±0,35
Qua bảng 8 cho thấy nhiệt độ trung bình dao động trong khoảng 29,4±0,25 đến
29,6±0,35
o
C. Nhiệt độ buổi chiều (30,4±0,41
o
C) luôn cao hơn buổi sáng (28,7±0,20
o
C là
0,23mg/l.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Copyright: Tài liệu đại học ©