BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

iii
LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã
đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững
chắc cho em trong cuộc sống sau này. Để có đƣợc những thành công bƣớc đầu nhƣ
ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Ba má là những ngƣời đã có công sinh thành, dƣỡng dục và luôn là chỗ dựa
tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học.
Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ƣu tú, rất tận tụy trong công tác, là ngƣời
đã vạch ra hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt
đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng đƣợc tiếp thu thêm
nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản.
Thầy Nguyễn Văn Út là ngƣời rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp
hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho
em làm cơ sở áp dụng trong đề tài.
Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực
hiện đề tài.
Hai anh Khƣu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ
Khánh Hƣng là những ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ,
cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những ngƣời đã giúp
đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống.


Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trƣờng Fert- TALP là 0,4%, trên môi trƣờng
TYH là 0%.
v
SUMMARY

TRUONG THI HOANG DIEU. Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology
Department of Nong Lam University.
Advisor:
Prof: TRAN THI DAN
Engineer: NGUYEN VAN UT
Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”.
Period: from the 1
st
Match, 2007 to the 15
th
August, 2007.
Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal
Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University.
In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive
biotechnology. Embryos are used for stem cell technology, animal breeding,
conservation of valuable mammalian species,… including dog.
The thesis consists of three experiments:
To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on
mature oocyte rate.

Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Buồng trứng 3
2.1.1 Vị trí, hình thái 3
2.1.2 Cấu tạo 3
2.1.3 Chức năng 3
2.2 Nang noãn 4
2.2.1 Đặc điểm hình thái 4
2.2.2 Sự phát triển của nang noãn 4
2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng 6
2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn 7
2.2.4.1 Trƣởng thành nhân 7
2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất 8
2.2.5 Sự rụng trứng 9
2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) 9
2.3.1 Lịch sử IVM 9
2.3.2 Môi trƣờng IVM 10
vii
2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM 10
2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM 10
2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM 12
2.3.3.1 Thời gian 12
2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn 13
2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái 13
2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng 13
2.4 Phó tinh hoàn 13
2.5 Tinh trùng 15
2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng 15

3.3.3.2 Thiết bị 31
3.4 Bố trí thí nghiệm 32
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để
nuôi chín trứng 32
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình
nhuộm trứng 32
3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng
Fert-TALP và TYH 32
3.5 Phƣơng pháp tiến hành 33
3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ 33
3.5.2 Xử lý buồng trứng 35
3.5.3 Tìm và rửa trứng 35
3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi 35
3.5.5 Nuôi trứng 36
3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 36
3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi 36
3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi 37
3.5.7 Nhuộm trứng 38
3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ 39
3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng 39
3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng 39
3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: 39
ix
3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh 40
3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP 41
3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH 42
3.6 Xử lý số liệu 42

FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn
GSH Glutathione
GV Germinal vesicle Túi mầm
GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm
In vitro Trong ống nghiệm
In vivo Trong cơ thể sống
UI Unit international Đơn vị quốc tế
IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm
IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm
IVM In vitro maturation Trƣởng thành trong ống nghiệm
LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng
M Metaphase Kỳ giữa
mm milimet
NCSU North Carolina State University
T Telophase Kỳ cuối
xi
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG
Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng 6
Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân 8
Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành 9
Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng 20

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn 15
Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó 34
Bảng 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 43
Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein 45
Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP 47
Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng 38
Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh 41 1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong lĩnh
vực sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại
nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Trong sinh sản vô tính nổi bậc
nhất là tạo con vật cloning, còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là
tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro culture - IVC), mục tiêu là cải tiến, hoàn thiện
quy trình tái sinh sản động vật trong điều kiện in vitro gần giống nhƣ điều kiện in
vivo để từ đó đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố sinh lý và sinh hóa làm cơ sở cho các
nghiên cứu khoa học và y học phục vụ cuộc sống.
Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) là một giai đoạn quan
trọng trong toàn bộ quy trình tạo phôi. Phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong
chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y
học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi hay một ý
nghĩa quan trọng là bảo tồn những loài động vật quý hiếm. Phôi còn là nguồn


3
Chƣơng 2

2.2 Nang noãn
2.2.1 Đặc điểm hình thái (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997)
Noãn (trứng) là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích noãn lớn hơn
tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần tinh trùng. Noãn (trứng) có cấu tạo gồm 3 phần:
Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất hữu
cơ, muối khoáng và vật chất khác.
Nhân gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.
Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong.
Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế
bào này đƣợc phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các
tế bào này đƣợc gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men
hyaluronidase ở phần acrosom đƣợc tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng
phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh.
Màng giữa gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi
dƣỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dƣỡng
cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu
chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá
trình thụ tinh.
Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi
là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi
dƣỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng
trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao.
2.2.2 Sự phát triển của nang noãn
Trong suốt quá trình hình thành phôi, tế bào mầm nguyên thủy phát triển từ
trung bì ở túi niệu, định vị tại buồng trứng, sau đó tăng lên về số lƣợng và biệt hóa
thành nang noãn nguyên thủy. Nang noãn nguyên thủy ngừng phát triển đến giai
đoạn cơ thể thành thục về mặt sinh dục.
Khi đƣợc sinh ra, buồng trứng thú cái đã có sẵn các nang noãn nguyên thủy và
nang noãn bậc một cho hoạt động sinh sản suốt đời. Nang noãn bậc một có thể thoái


LH trong huyết thanh.
FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích
thích quá trình phân bào nguyên nhiễm của tế bào hạt (có sự hỗ trợ của estradiol),
quá trình hình thành dịch nang trứng. FSH còn làm tăng khả năng cảm ứng của tế
bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lƣợng các thể tiếp nhận LH, đây là sự chuẩn
bị cho quá trình lutein hoá của các tế bào hạt trong việc đáp ứng sóng gây rụng
trứng của LH. Theo Davol (2000), trên chó 2 ngày trƣớc khi rụng trứng, tuyến yên
tăng tiết LH làm cho nang noãn phồng lên nhanh chóng, nang noãn tiến dần lên bề
mặt buồng trứng và khi tỷ lệ LH/FSH phù hợp thì sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất noãn,
nếu vắng mặt LH thì không xảy ra sự xuất noãn.
Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng
(Nguồ n: Cummings, 2001) 7
Estrogen do các tế bào hạt trong nang tiết ra. Estrogen cần thiết cho sự duy trì
và phát triển của buồng trứng, cấu trúc sinh sản và đặc điểm sinh dục thứ cấp ở
động vật cái. Có ý nghĩa quan trọng trong việc thúc đẩy trứng phát triển, chín và
rụng, phát triển niêm mạc tử cung, tăng hàm lƣợng actin và myosin trong giai đoạn
mang thai, tăng sinh mô tuyến của niêm mạc và tế bào biểu mô lông rung của ống
dẫn trứng giúp trứng đã thụ tinh di chuyển dễ dàng vào tử cung.
Progesteron đƣợc phân tiết chủ yếu từ hoàng thể. Progesteron kích thích tăng
sinh niêm mạc tử cung, giúp tử cung có khả năng bài tiết, giảm co bóp cơ tử cung
tạo môi trƣờng yên ổn sẵn sàng đón chờ trứng đã thụ tinh vào làm tổ, kích thích
niêm mạc ống dẫn trứng bài tiết dịch chứa chất dinh dƣỡng nuôi phôi, progesteron
còn có tác dụng kích thích bài tiết prolactin làm tăng phát triển các ống sữa của
tuyến vú. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh bắt đầu tăng lên ở giai đọan
động dục, ở chó sau khi hàm lƣợng progesterone tăng đến 2 ng/ml thì sự xuất noãn
sẽ xuất hiện sau đó 2 ngày, do đó hàm lƣợng progesterone cũng là một chỉ tiêu hiệu
quả để xác định thời điểm phối giống trong thụ tinh nhân tạo (Davol, 2000).
2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất
Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra nhiều
biến đổi. Noãn trở nên mọng nƣớc, các phiến noãn hoàng trong nƣớc và dần hòa tan
vào nhau, noãn trở nên trong hơn. Trong noãn xảy ra sự tăng áp suất nội bào, giảm
tính thấm, lớp tế bào chất ở bề mặt có khả năng co giãn và xuất hiện khả năng phân
chia (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Các bào quan trong tế bào chất đƣợc tổ chức lại
chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển phôi.
Sự trƣởng thành tế bào chất là yếu tố gián tiếp quyết định khả năng phát triển của
noãn để có thể xảy ra hiện tƣợng thụ tinh bình thƣờng, phân chia và phát triển tới
Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân
(Nguồn: Mario Mayes, 2002) 9
phôi nang (blastocyst). Nếu chỉ có sự trƣởng thành về nhân mà không có sự trƣởng
thành về tế bào chất thì sẽ không đảm bảo cho sự phát triển phôi sau này (Sirard et
al., 1989; Yang et al., 1998).
C là nhiệt độ tối ƣu để noãn bò
trƣởng thành in vitro.
Năm 1988, Lu và cộng sự cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh
in vitro.
Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật
IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ.
Ngày nay kỹ thuật IVM đã đƣợc thực hiện thành công trên rất nhiều loài
động vật và đặc biệt là trên ngƣời, làm cơ sở cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
(in vitro fertilization - IVF), chuyển cấy phôi và chuyển gen. ngày nay kỹ thuật
IVM vẫn đang đƣợc rất chú trọng và phát triển.
2.3.2 Môi trƣờng IVM
2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM
Môi trƣờng đơn giản: là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối nhƣ
pyruvate, lactate, glucose. Các môi trƣờng thƣờng đƣợc cung cấp huyết thanh hay
albumine và một lƣợng thích hợp các kháng sinh (penicillin, streptomycin,
gentamycin).
Môi trƣờng phức tạp thƣờng chứa thêm một số yếu tố nhƣ amino acid,
vitamine, purine và những chất khác.
2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM
 Thành phần chính
- Nƣớc
Nƣớc là thành phần chính cho mọi loại môi trƣờng. Nƣớc sử dụng trong
IVM phải đƣợc qua hệ thống chƣng cất, siêu lọc, hấp vô trùng để loại bỏ các chất
khoáng, ion và nguồn gây nhiễm trong nƣớc.
- Nguồn năng lƣợng
Glucose, lactate, pyruvate là những nguồn năng lƣợng ngoại sinh quan trọng
nhất cho sự phát triển của trứng và phôi. Tuy nhiên tùy vào từng giai đoạn phát triển 11

+
. Hàm lƣợng các ion trong môi trƣờng dựa vào thành
phần các chất khoáng trong huyết tƣơng máu. 12
- Hệ đệm
Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dƣới 5 % CO
2

.Cơ chế của hệ đêm
này cũng giống nhƣ hệ đệm trong sinh lý máu. Hệ đệm có vai trò quan trọng là ổn
định nồng độ CO
2
và pH của môi trƣờng.
- Kháng sinh
Các loại kháng sinh thƣờng dùng là penicillin, streptomycin, gentamycin.
Các loại kháng sinh đều có vai trò quan trọng nhất là giảm nguy cơ nhiễm khuẩn từ
các tác nhân bên trong và bên ngoài trong quá trình nuôi cấy.

Thành phần bổ sung

- Hormon
Hầu hết các môi trƣờng IVM đều đƣợc bổ sung hormon, đặc biệt là FSH và
LH. FSH giúp noãn giãn nở hạt tụ và vƣợt qua chƣớng ngại trong giảm phân nhƣng
không giúp phát triển hơn nữa. Ngoài ra còn bổ sung estradiol, progesteron vào môi
trƣờng. Tỷ lệ MII khi thêm estradiol (14,7%) cao hơn so với đối chứng(1,5-8,2%),
khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) (Kim et.al., 2005).
- Yếu tố tăng trƣởng
Trên chó, EGF đƣợc thu từ ống dẫn trứng. EGF đƣợc thêm vào môi trƣờng

2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng
Nhiệt độ tốt nhất bảo quản mẫu buồng trứng là 37
o
C trong môi trƣờng nƣớc
muối sinh lý có đệm phosphate (phosphate buffered saline - PBS), thời gian tối đa
cho phép trữ mẫu từ lúc lấy buồng trứng ra ngoài cơ thể là 2 giờ (Kim et.al., 2006).
Ngoài ra còn có một số yếu tố khác nhƣ: điều kiện vô trùng, thao tác ngƣời
thực hiện, tủ nuôi cấy…
2.4 Phó tinh hoàn
 Vị trí: nằm ở một bên thân và đầu dƣới của tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung
và ctv, 2005)
 Cấu tạo
Về giải phẫu học, phó tinh hoàn gồm 3 phần (Hoàng Văn Tiến và ctv, 1995).
Đầu: có rất nhiều ống dẫn ra (13 đến 20) đính vào ống dẫn của phó tinh hoàn,
tạo nên một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của tinh hoàn.