TCNCYH 38 (5) - 2005
SỰ SAO CHÉP HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN
(HIP) Ở MÔ UNG THƯ VÚ

Phan Tôn Hoàng
1
, Tạ Thành Văn
2
1
Khoa Hóa sinh - Bệnh Viện Bạch Mai
2
Bộ môn Hóa - Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nộit
t t

I Heparansulfat Interacting Pro ein (HIP) được tổng hợp với nhiều mức độ khác nhau ở các dòng tế bào
và mô đặc biệt ở dòng tế bào ung thư. Điều đó cho phép chúng tôi đưa ra giả thiết: HIP được tăng cường
ổng hợp ở cả mức độ mRNA và pro ein tại mô ung thư vú. Mục tiêu: Thiết kế mồi HIP và đánh giá mức
độ sao chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú đối chiếu kết quả của các phương pháp xét nghiệ
m cận lâm
sàng khác. Phương pháp: Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA và khuếch đại gen mã hóa H P sử
dụng mồi đặc hiệu. Kết quả: Mồi HIP đã khuếch đại đặc hiệu gen mã hóa HIP. mRNA của HIP được sao
chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú trong khi không phát hiện được ở mô u xơ. Kết quả xét
nghiệm sinh học phân tử này tương ứng với các kết quả xét nghiệm XQ và tế
bào học. Kết luận: Mồi HIP
do chúng tôi thiết kế đã khuếch đại thành công gen mã hóa HIP và sự sao chép mRNA của HIP được tăng

biểu mô, trong khi không phát hiện được ở dòng
tế bào sợi và tổ chức liên kết [6]. Với việc sử dụ
ng
dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại của
bệnh nhân ghép tạng sử dụng cyclosporin A (CsA)
trong mô hình nghiên cứu thực nghiệm in vitro, Tạ
Thành Văn và cộng sự cho thấy HIP có khả năng
điều hoà sự lưu trữ và giải phóng yếu tố phát triển
tế bào để thông qua đó tham gia vào quá trình
điều hoà sự phát triển và biệt hoá của tế bào [2,
3, 7]. Wang Y và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng
mHIP và HIP protein được tă
ng cường tổng hợp ở
các dòng tế bào và mô ung thư đại tràng. Đồng
thời sự tăng cường tổng hợp này tuỳ thuộc vào các
giai đoạn phát triển và biệt hoá của khối u [8]. Sự
khác biệt về mức độ tổng hợp HIP đã cho phép tác
giả đề nghị một khả năng là dùng HIP như là một
dấu ấn đánh giá mức độ phát triển bất thường của
tế bào trong giai đoạn tiền ung thư đại tràng.
Cũng trong thời gian này nhóm các tác giả người ý
cũng đã phát hiện ra rằng cả gen mã hoá HIP và
HIP protein cũng được tăng cường tổng hợp ở các
dòng tế bào và mô ung thư tuyến giáp trạng.
Lượng mARN và HIP protein đều được xác định là
phụ thuộc vào quá trình phát triển và biệt hoá của
tế bào ung thư giáp trạng [4]. Carson D và cộng
sự, tác giả của việc phát hiện ra HIP đã công bố:
Sự tổng hợp của HIP liên quan đến các dòng tế
bào ung thư vú người đặc biệt là các dòng tế bào

chọn bệnh nhân
Gồm 3 trường hợp bị ung thư vú giai đoạn 3 đã
được chẩn đoán xác định của lâm sàng, cận lâm
sàng (mô bệnh học, XQ, hoá sinh) tại bệnh viện K
Trung ương. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: bệnh
nhân chỉ bị ung thư vú, không mắc bất kỳ loại hình
bệnh tật, ung thư nào khác.
2. Hoá chất
Các hoá chất tách chiết RNA tổng số
gồm:
Isogen, chloroform, isopropanol, ethanol, diethyl -
pyrocarbonat (DEPC) được mua từ Walko. Các hoá
chất dùng để tổng hợp cDNA như random primer,
dNTP 10mM, PCR 5x buffer, dithionthritol 0,1M
(DTT), Moloney Murine Leukemia Virus - Reverse
Trancriptase (MMLV - RT), RNase out, được mua
từ Invitrogen. Cặp mồi để khuếch đại gen HIP và
GAPDH được mua từ Invitrogen.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Lấy mẫu và tách chiết RNA tổng số
- Lấy mẫu: Ngay sau khi bệnh nhân được phẫu
thuật cắt bỏ khối u, bệnh phẩm được chuyển đến
khoa Giải phẫu bệnh, làm chẩn đoán mô bệnh học
xác định ung thư trong khoảng thời gian 30 - 45
phút. Mẫu được lấy vào lọ vô trùng, bảo quản ở -
80
0
C.
- Tách chiết RNA tổng số: nghiền 120 - 150 mg
bệnh phẩm với 1ml Isogen để trong cối sứ tạo

20 lần, dNTP 10mM, DTT 0,1M, enzym ức chế
phân huỷ RNA (RNAase out), PCR 5x buffer và
nước cất dùng cho PCR có DEPC.
- Tiến hành: Cho vào 1 ống eppendorf sạch:
RNA tổng số: 5 µg
DEPC - water: 1 µl
Trộn nhẹ nhàng, ủ 65
o
C trong 5 phút, trong đá
lạnh 1 phút sau đó thêm:
Random primer: 2 µl
dNTP 10mM: 5 µl
Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, trong đá lạnh 1
phút sau đó thêm:
PCR 5X buffer: 4 µl
DTT 0,1M: 1 µl
RNAase out: 1 µl
MMLV-RT: 1 µl
Tổng thể tích phản ứng là: 20µl. Quy trình
nhiệt độ cần thiết cho quá trình tổng hợp cDNA
trên máy PCR như sau: 37
0
C: 55 phút; 70
0
C: 15
phút và 4
0
C để bảo quản tạm thời, và sản phẩm
cDNA được bảo quản dài ngày ở -20
o

nhau dựa vào đậm độ của vạch điện di GAPDH của
mỗi mẫu thử. Mồi HIP được thiết kế có trình tự

như sau: Mồi xuôi: 5' GCT TAT GGT GCA GAC ATG
G 3', và mồi ngược: 5' CGA AGT CTC ATC TAT AGA
GAC 5'. Với cặp mồi này đoạn gen của HIP với
chiều dài 420 bp sẽ được khuếch đại. Nhiệt độ gắn
mồi (Tm) của HIP được xác định trong khoảng
58
0
C - 60
0
C và chu kỳ (35 chu kỳ) nhiệt của phản
ứng PCR là: 94
0
C trong 5 phút; 94
0
C trong 30
giây; 58
0
C trong 20 giây; 72
0
C trong 20 giây; 72
0
C
trong 5 phút; và 4
0
C để bảo quản tạm thời. Sản
phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose
1,5 sử dụng Hae III làm macker chuẩn.

Khối u có đường kính lớn hơn 5 cm, ranh giới không rõ ràng, xâm lấn các tổ chức xung quanh kèm
theo vôi hoá ác tính (A và B).
7
TCNCYH 38 (5) - 2005
2. Đánh giá sản phẩm quá trình sao chép
(mRNA) của HIP ở mô ung thư vú
Gen mã hóa GAPDH được khuếch đại và được
sử dụng như là chất nội chuẩn để đánh giá chất
lượng sản phẩm cDNA và làm căn cứ để tính nồng
độ cDNA sẽ được dùng trong phản ứng PCR để
khuếch đại gen mã hóa HIP. Trọng lượng phân tử
của sản phẩm khuếch đại GAPDH khoảng 350 bp
cho thấy việc tách chiế
t RNA tổng số từ mô ung
thư vú và kỹ thuật RT - PCR thành công cho kết
quả tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng khuếch
đại gen mã hóa HIP ở phản ứng tiếp theo (hình3).

Hình 3. Kết quả PCR khuếch đại gen mã
hóa GAPDH.
Gen mã hóa GAPDH được sử dụng như một
gen nội chuẩn. Kết quả cho thấy sản phẩm cDNA
ốt, đảm bảo cho phản ứng khuếch đại gen mã
hóa HIP. 1, mẫu bệnh phẩm u xơ vú; 2 - 4 mẫu
bệnh phẩm ung thư; và 5, nước cất.

t
,
Nồng độ cDNA trong phản ứng khuếch đại gen
mã hóa HIP sẽ được ước định đảm bảo cDNA mã

thường này là bi
ểu hiện rối loạn sớm nhất của quá
trình bệnh lý học ung thư trước khi thể hiện ra ở
mức độ tế bào để có thể chẩn đoán được bằng các
kỹ thuật tế bào học. Chính vì vậy, các kỹ thuật
chẩn đoán sinh học phân tử có tác dụng phát hiện
sớm, chính xác bệnh lý ung thư để có thể áp dụng
những biện pháp điều trị can thiệ
p sớm nhất và
hiệu quả.
Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy HIP là
một protein màng gắn đặc hiệu với HS thông qua
đó tham gia điều hòa các quá trình lưu giữ, giải
phóng các protease và yếu tố phát triển tế bào.
HIP chỉ được tổng hợp ở các dòng tế bào nội mạc
biểu mô mà không phát hiện thấy ở các dòng tế
bào sợi và tổ chức liên kết. Trong nghiên cứu này
chúng tôi đã sử dụng 3 mẫu mô ung th
ư vú ở giai
đoạn 3 và 1 mẫu u xơ để đối chứng. Kết quả xét
nghiệm hóa sinh máu và nước tiểu giúp loại trừ
một số trường hợp bệnh lý khác. RNA tổng số
được tách chiết từ các mẫu mô tươi theo một quy
trình chuẩn và sau đó sử dụng để tổng hợp cDNA.
Kết quả PCR sử dụng mồi GAPDH đã khuếch đại
thành công đoạn gen mã hoá GAPDH có chiều dài
350 bp cho thấ
y sản phẩm cDNA thu được tốt và
có thể sử dụng để đánh giá mức độ sao chép của
HIP. Trong phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP,

kháng HIP nhằm ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn
dịch hàng loạt (Tissue Array) để chẩn đoán sàng
lọc nhanh, hàng loạt cho các mô sinh thiết vú góp
phần chẩn đoán sớm ung thư bởi lẽ sự thay đổi về
gen và protein bao giờ cũng là sự thay đổi sớm
nhất trước khi xuất hiện sự thay đổi hình thái tế
bào.
V. KẾT LUẬN
Những kết quả thu được từ nghiên cứu cho
chúng tôi rút ra kết luận:
1. Tách chiết RNA tổng số từ mô ung thư vú và
tổng hợp thành công cDNA.
2. Thiết kế thành công mồi HIP, sử dụng mồi
HIP để xác định mức độ sao chép ở mô ung thư
vú.
3. Kết quả thu được cho thấy mRNA của HIP
được tăng cường sao chép trong mô ung thư vú và
tương ứng với các kết quả XQ và tế bào học.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tạ Thành Văn (1998). Heparin: Sự
tương tác với Protein. Tạp chí nghiên cứu Y học 6,
69 - 72.
2. Tạ Thành Văn (2004). Phân lập và nghiên
cứu sự đáp ứng của dòng tế bào sợi từ mô lợi phì
đại với bFGF và heparin. Y học Việt Nam 299, 38 -
43.
3. Tạ Thành Văn và M.C. Farach- Carson
(2004). Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của
protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế

regulated in human colorectal carcinoma and
correlated with differentiation status and
metastasis. Cancer Res. 59, 2989 - 2994.
Summary

9
TCNCYH 38 (5) - 2005
HEPARANSULFAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN BREAST
CANCER TISSUES

Heparan sulfate interacting protein (HIP/L29) was first identified from a human uterine adenocarcinoma
cell line. HIP is expressed at different levels in a variety of human cell line and normal tissues. In addition,
HIP was found to be up expressed in some cancer cell lines including thyroid, breast cancer cell lines and
HIP expression was tightly depended on malignant level of each cancer cell types and colon cancer cell line
and tissues. Objectives: To evaluate HIP transcript in breast cancer tissue. Methods: total RNA
extraction and RT - PCR for HIP mRNA determination. Results: HIP transcript was up regulated in breast
cancer tissue and correlated with clinical data. Conclusion: HIP transcript was up regulated in breast
cancer tissue. This finding provides preliminary data to develop a new technique for fast screening of
breast cancer as new method for early cancer diagnosis.
Keywords: HIP/L29; breast cancer; transcript
10