ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƯỢNG
VÀ ĐỊNH LƯỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP
CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ
UNG THƯ

Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương
pháp đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao được sử dụng rất
rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại sau
mỗi phản ứng PCR.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng
để đánh giá mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở
mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên.
Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính;
tổng hợp cDNA; xác định mức độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp
PCR bán định lượng và định lượng.
Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau;
HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát
hiện được rất thấp trên mẫu lành tính.
Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính
khác biệt nhau một cách rõ rệt. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương
pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức độ sao chép
của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.

ABSTRACT
Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple
methods. They are commonly used to determine amplified gene levels in
PCR reaction.
Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR
methods to determine HIP transcript levels in cancer and normal tissue; to
evaluate sensibility of tow methods.
Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues,

lấn của ung thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng ung thư
(1,7)
.
Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra
phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là một lĩnh vực đang được
rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu gần đây, bằng
phương pháp RT-PCR chúng tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao
chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt
trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp ở mô u xơ
(4,5)
.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định
lượng và định lượng để xác định mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, từ
đó so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp trên để ứng dụng
chúng xác định mức độ sao chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán
bệnh ung thư.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng, cận
lâm sàng (siêu âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K Hà nội. Chúng
tôi sử dụng 15 mẫu mô lành tính để làm đối chứng.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA
RNA tổng số được tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn đã
được mô tả trước đây
(5)
. 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp chuỗi
cDNA bổ xung bằng phản ứng reverse transcript-polymerase chain reaction
RT- PCR.
Phương pháp PCR bán định lượng

Kết quả PCR định lượng được biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh.
GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản
ứng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Để xác định mức độ sao chép của HIP, sử dụng cặp mồi đặc hiệu với
HIP chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR bán định lượng trên những mẫu
RNA tổng số tách từ mẫu ung thư và mẫu lành tính. Sau khi được điện di
trên agarose 2%, sản phẩm PCR nhận được có kích thước phân tử 444 bp
(hình 1a). Quan sát chúng ta thấy đậm độ vạch PCR ở những mẫu ung thư rõ
hơn so với những mẫu lành tính, kết quả gợi ý rằng HIP tăng cường sao chép
ở những mô ung thư trong khi đó sao chép rất thấp ở những mô lành tính.

a.
1 2 3 4 5 6
7

HIP

GAPDH 1 2 3 4 5
6 7

b.
M

G
M
M

G
M
M

G
M
M

G
1
2
3
4
5
6
7
HIP
M
M

H
M
M
H

BÀN LUẬN
Việc nghiên cứu tìm hiểu những gen tăng cường tổng hợp ở mô ung
thư sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phân tử của bệnh, từ đó cho phép chúng ta
tìm ra những marker có giá trị để chẩn đoán xác định và mức độ tiến triển
của mô ung thư. HIP là một protein bề mặt tế bào được phát hiện lần đầu
tiên ở dòng tế bào biểu mô thận người và được tổng hợp rất nhiều ở các
dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. HIP gắn trực tiếp vào
Heparin, một loại protein có khả năng tương tác với nhiều loại protein khác
nhau vì vậy HIP tham gia vào quá trình liên kết tế bào – tế bào, tế bào –
khoảng gian bào. Rohde và cộng sự đã chứng minh rằng HIP giúp cho
những tế bào trophoblast gắn vào biểu mô thận và tăng cường quá trình xâm
lấn tế bào. Một vài nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây đã chứng minh
rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả
mức độ RNA thông tin và protein
(1,4,5,7)
. Sự tăng cường tổng hợp của HIP ở
những mô ung thư sẽ thúc đẩy sự tương tác tế bào-tế bào, tế bào-ngoại bào
đồng thời nó có thể đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển, khư trú và
xâm lấn của khối u.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã dùng phương pháp RT-PCR bán
định lượng và định lượng để xác định mức độ biểu hiện của gen HIP ở mô
ung thư so sánh với mô lành tính. Đây là những kỹ thuật đơn giản, chính xác
và cho độ tin cậy tương đối cao. Cả 2 phương pháp này đều cho kết quả
tương tự như nhau: HIP được tăng cường tổng hợp rất rõ ở những mô ung
thư trong khi đó phát hiện được rất thấp ở mô lành tính. Điều này giúp cho
chúng tôi có những định hướng tiếp theo và có thể ứng dụng những phương
pháp này như một công cụ hữu ích không chỉ trong việc đánh giá mức độ
biểu hiện của HIP ở những mô ung thư mà trong cả việc nghiên cứu tìm hiểu
đánh giá mức độ biểu hiên của những marker khác trong chẩn đoán bệnh
ung thư.