TCNCYH 22 (2) - 2003
Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi
(multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy

Trần Trí Tuệ
1
, Lê Văn Phủng
2
1
Trung tâm Y tế dự phòng Lào cai
2
Đại học Y Hà Nội

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi trong xác định các chủng E. coli gây tiêu
chảy đã đợc nghiên cứu chi tiết. Sự phân bố của 300 chủng E. coli phân lập từ các bệnh phẩm:
phân (150), nớc tiểu (40), máu (30), dịch mật (40), mủ (40) cũng đã đợc xác đinh bằng PCR đa
mồi dùng trong tiêu chảy.
ADN đợc tách chiết từ các chủng E. coli và các chủng chuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae,
sau đó tiến hành phản ứng PCR với 8 cặp mồi. Kết quả nh sau:
1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) so với chủng chuẩn là 100%.
2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR với 8 cặp mồi đã chọn từ các vi khuẩn: Citrobacter freundii,
Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwasdsiella
tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%.
3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng phản ứng PCR với bộ mồi đã thiết kế cho EIEC
Jal.
4. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ trẻ em khoẻ mạnh là 10% (EAEC 6,7%; EHEC
0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%).
5. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ mủ, dịch mật, máu, nớc tiểu là 1,33% và có
sự phân bố không đồng đều theo vị trí gây bệnh.
đặc hiệu, quyết định khả năng gây bệnh của E.
coli, trong đó 2 phơng pháp, PCR và lai ADN,
đợc áp dụng phổ biến nhất.

5
TCNCYH 22 (2) - 2003
ở Việt Nam, việc chẩn đoán E. coli gây tiêu
chảy, chỉ sử dụng phơng pháp quai ruột và
định type huyết thanh và cũng chỉ dừng lại ở
ETEC (Enterotoxingenic E. coli) và EPEC
(Enteropathogenic E. coli), EIEC
(Enteroinvasive E. coli), EHEC
(Enterohaemorrhagic E. coli). PCR chẩn đoán
E. coli trên thế giới đã đợc dùng phổ biến
nhng các tác giả đều chỉ dùng đơn thuần một
cặp mồi cho một phản ứng, do vậy tốn kém vật
liệu và thời gian. Bởi vậy, việc nghiên cứu áp
dụng một kỹ thuật phù hợp với nhiều cặp mồi,
nhằm phát hiện nhiều loại E. coli gây tiêu chảy
trong một phản ứng là hết sức cần thiết và có ý
nghĩa thiết thực. Trớc tình hình đó chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu:
1. Tìm hiểu độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng PCR đa mồi trong xác định E. coli
gây tiêu chảy.
2. Tình hình phân bố các chủng E. coli có
khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu,
nớc tiểu, mủ và mật.
II. Đối tợng, vật liệu và phơng
pháp nghiên cứu

VT1 l-VT1 r, VT2 l-VT2 r, eae u-eae l, SHIG
1-SHIG 2, bfp2 u-bfP2 l, EA L-EA U.
+ Máy ly tâm lạnh (Beckman Avanti TM
30), máy điều nhiệt tự động Thermal Cycler
(Eppendorf Đức), bộ điện di ngang (Advance
Co.LTD, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel và phim
ảnh Kodak cỡ 667.
3. Phơng pháp

- Từ các chủng E.coli mẫu, các chủng thuộc
họ vi khuẩn đờng ruột đã kể ở trên và các
chủng vi khuẩn, bệnh phẩm đợc tách chiết
ADN bằng nhiệt theo quy trình của Viện
Krolinska Thụy Điển.
- Sau đó tiến hành chạy phản ứng PCR đa
mồi (8 cặp mồi) với chu kỳ nh sau: 1 chu kỳ
96
o
C/4"; 30 chu kỳ: 94
o
C/20", 50
o
C/20",
72
o
C/10"; 1 chu kỳ: 72
o
C/7" giữ ở 4
o
C.


Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi với các vi khuẩn
có quan hệ di truyền gần gũi với E. coli

1. Chứng âm 2. Edwardsiella tarda 3. K. pneumoniae 4. P. vulgaris
8

2030
(bp)
1636
1018

506,517
396
344
298
220
201
154
134
9
10
1 2 3 4 5 6 72036 (bp)
1636

ETEC 2 1,33
Tổng cộng
15 10
4. E. coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt
ở ngoài đờng tiêu hoá
Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng E. coli
có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ các bệnh
phẩm ngoài đờng tiêu hoá (n = 150)
Tên chủng PCR (+) %
EAEC
2 1,3
EHEC 0 0
EIEC 0 0
EPEC 0 0
ETEC 0 0
Tổng cộng 2 1,3
IV. Bàn luận
Về độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi: kết
quả độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi của các
chủng E. coli mẫu là 100%. Mặc dù sử dụng
nhiều cặp mồi hơn song chúng tôi thấy rằng
không có hiện tợng ức chế lẫn nhau giữa các
cặp mồi trên. Kết quả của chúng tôi phù hợp
với kết quả nghiên cứu của các tác giả trớc
nh Katsuaki Hoshino Or Jan Olsvik, Akioabe,
Sandrinsa Tacyphipps mặc dù chúng tôi sử
dụng nhiều cặp mồi hơn. Chúng tôi cũng tiến
hành thử nghiệm độ lặp lại (100 lần) với các
chủng E. coli mẫu. Kết quả độ lặp lại của PCR
trong các chủng E. coli mẫu là 100% (trừ

thực tế chẩn đoán.
Tiến hành xác định độ đặc hiệu của phản
ứng PCR với các chủng Shigella thì thấy rằng
không thể phân biệt đợc các chủng Shigella
với E. coli bằng PCR với các cặp mồi đã thiết
kế cho EIEC. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của các tác giả trên thế giới vì Shigella và
EIEC rất giống nhau về mặt di truyền học. Để
phân biệt chúng cần phải thiết kế một số cặp
mồi đặc hiệu hơn.
E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá: Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng tỷ lệ E. coli
có khả năng gây tiêu chảy ở đờng tiêu hoá là
10%. Kết quả này tơng đơng với nghiên cứu

8
TCNCYH 22 (2) - 2003
của các tác giả khác thuộc các nớc lân cận
nh Lào 11%, ân Độ 9%, Tây Thái Lan 7%,
nông thôn Israel 11% [4, 6, 8, 10] tuy hơi cao
hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác
giả trong nớc nghiên cứu trớc đây nh:
Hoàng Tiến Mỹ 1,6%; Nguyễn Phơng Lan
3,5%; Hoàng Thu Thuỷ 5% [1, 2, 3]. Trong
nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm EAEC là
cao nhất 6,7%, đây là một tác nhân gây bệnh
mới đợc quan tâm gần đây. Tuy nhiên theo
kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nớc
và các nớc lân cận nh Lào, Thái Lan [8, 10]
thì cha phát hiện đợc các trờng hợp nhiễm

lập từ mủ. Điều này gợi ý cho chúng ta thấy
rằng các chủng E. coli ngoài khả năng gây tiêu
chảy còn có khả năng gây bệnh ở những nơi
khác. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy gây bệnh ở
ngoài đờng tiêu hóa thấp hơn E. coli gây bệnh
ở đờng tiêu hóa với một tỷ lệ có ý nghĩa thống
kê (p < 0,05).
V. Kết luận
Qua nghiên cứu chúng tôi có một số kết
luận sau:
1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) với
các chủng chuẩn là 100%.
2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR 8 cặp mồi đã chọn
với các vi khuẩn Citrobacter freundii, Salmonella
typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda,
Escherichia coli ATCC 25922 là 100%.
3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng
phản ứng PCR với cặp mồi (đã thiết kế cho
EIEC) ial.
4. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập ở trẻ
khoẻ mạnh là 10% trong đó EAEC 6,7%;
EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC
1,33%. Có sự phân bố không đồng đều giữa 3
địa phơng đó là: Sa Pa 20%, Thanh Trì 6%,
Cát Bà 4%.
5. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập từ mủ,
mật, nớc tiểu và máu là 1,33% và có sự phân
bố không đồng đều giữa các vị trí gây bệnh:
mủ 2,5%, mật 2,5%, máu 0%, nớc tiểu 0%.

settlement in Israel. J. Pediatrics infect. Dis,
13(2): 116-22.

7. Paniagua M., Espinoza ., Ringman M
(1997), Analysis of incidence of infection with
enterotoxigenic Escherichia coli in a
prospective cohort study of infant diarrhea in
Nicarago. J. Clin. Microbiol, 35 (6): 1404 -
1410.
8. Peter Echeverria, Charles W.Hoge (1994),
Etiology of diarrhea in a rural community in
Western Thailand: Importance of enteric vruses
and enterovirulent Escherichia coli". J.
infect. Dis, 169: 916-9.
9. Quiroga M, Oviedo P (2000), Asymptomatic
infections by diarrheagenic Escherichia coli in
children from Misiones, Argentina, During the
first twenty months of their lives. Rev. Isnt.
Med. Trop. Saopaulo, 42 (1): 9-15.
10. Yamashiro T, Nakasone N, Higa N (1998),
Etiological study of diarrheal patients in
Vientiane, Lao Peoples Democratic Republic.
J. Clin. Microbiol, 36(8): 2195-9.
Summary
study on multiplex PCR in diagnosis
of diarrhea-causing E. coli
The study used 300 E. coli strains isolated from specimens: stool (150), urine (40), blood (30),
billiary fluid (40), pus (40) to find sensitivity and specificity of multiplex PCR in diagnosis of E.
coli strains causing diarrhea and distribution of E. coli which have ability causing diarrhea in these
specimens.