Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2008: Tp VI, S 5: 437-443 I HC NễNG NGHIP H NI
437
PHáT HIệN CáC CHủNG CƯờNG ĐộC GUMBORO NGUồN GốC ÂU-Mỹ TạI VIệT NAM
BằNG PHƯƠNG PHáP SINH HọC PHÂN Tử PHÂN TíCH GEN VP2
Detection of Virulent Gumboro Isolates of Euro-American Sublineage in Vietnam
by Molecular Analysis of Gene VP2
Lờ Th Kim Xuyn, Lờ Thanh Hũa
Vin Cụng ngh Sinh hc Vit Nam
TểM TT
c tớnh di truyn ca h gen virus Gumboro cú xu hng phõn chia cỏc chng trờn th gii
thnh 2 nhúm: nhúm cú ngun gc chõu v nhúm cú ngun gc u - M. Bng phn ng RT-PCR,
tỏch dũng v gii trỡnh trỡnh t, ton b gen VP2 (1359 bp) ca mt s chng virus Gumboro phõn lp
ti Vit Nam, ký hiu BDG23 (Bỡnh Dng), GPT (Phỳc Th) c thu nhn v phõn tớch thnh phn
gen so sỏnh vi cỏc chng Gumboro khỏc ca Vit Nam (GHUT1; GSG4; GT1ST; BDG) v th gii, bao
gm cỏc chng cng c SH92 (Hn Quc), HK46 (Hng Kụng), JD1 (Trung Quc), OKYM (Nht Bn),
52-70, D78 (M
) v cỏc chng vacxin Gvx2512, GvxBL (M). Da trờn qui lut bin i c lc v khỏng
nguyờn, chỳng tụi phõn tớch cỏc v trớ axớt amin l epitope ca protein VP2. Kt qu cho thy, chng
GPT l mt chng cng c mnh cựng nhúm vi cỏc chng khỏc ca Vit Nam v chõu . Trong khi
ú chng BDG23 l chng cú c lc yu v cựng vi chng GSG4 trc õy, u cú ngun gc chõu
u-M. Kt qu phõn tớch ph h cng khng nh tớnh hn hp a ngu
n gc ca cỏc chng virus
Gumboro phõn lp ti Vit Nam.
T khoỏ: Cng c, c lc, epitope, Gumboro, khỏng nguyờn, RT-PCR, ph h.
SUMMARY
Genetic properties of Gumboro virus tend to divide the strains into two different groups, ie Asian
and Euro-American sublineages. Using RT-PCR, cloning and sequencing, the entire VP2 (1359 bp) for
virulent Gumboro isolates recently collected in Vietnam, viz. BDG23 (Binh Dng) and GPT (Phuc Tho),
were obtained and genetically characterized with other Vietnamese (GHUT1; GSG4; GT1ST; BDG) and
foreign strains including SH92 (Korea), HK46 (Hong Kong), JD1 (China), OKYM (Japan), 52-70, D78,
Gvx2512, GvxBL (USA). Based on the variation rule for antigen and virulence in the VP2 sequence, it

biến đổi, dễ dng thu nhận bằng phơng
pháp RT-PCR (reverse transcriptase
polymerase chain reaction) v tách dòng
sản phẩm để giải trình trình tự (Lê Thanh
Ho, 2003; Lê Thị Kim Xuyến v cs., 2006).
Vùng siêu biến đổi ny mã hóa cho
khoảng 120-150 axít amin, ở đó có một số
axít amin quan trọng, lm khung cấu tạo
nên các epitope kháng nguyên, hay còn gọi
l quyết định kháng nguyên (antigenic
determinant) v l vị trí cấu trúc trên một
có thể phản ứng đặc hiệu với một phân tử
kháng thể (Fahey et al. 1989; Jackwood
and Sommer-Wagner, 2007). Những nghiên
cứu ở mức độ phân tử về virus Gumboro,
đặc biệt l những nghiên cứu về gen quy
định cấu trúc của kháng nguyên VP2 cho
phép hiểu biết sâu hơn về cơ chế biến đổi
của cấu trúc khung epitope kháng nguyên
VP2, m điều ny liên quan chặt chẽ đến
phản ứng miễn dịch, đến sự kết hợp giữa
kháng nguyên v kháng thể trong miễn
dịch chống virus Gumboro, từ đó lựa chọn,
sản xuất đợc vacxin thích hợp để phòng
chống bệnh truyền nhiễm ny một cách có
hiệu quả (Scherbacova et al. 1998; Lê
Thanh Ho, 2004).
Các axít amin tạo nên epitope có sự
thay đổi theo qui luật khi độc lực tăng
(cờng độc hoá) hoặc giảm (nhợc độc hoá),

Fabricius đợc rửa sạch bằng nớc muối
sinh lý, bảo quản ở -20
o
C cho đến khi sử
dụng để tách RNA tổng số.
Bộ kit chuẩn RT-PCR (QIAGEN, Mỹ)
đợc sử dụng để nhân ton bộ gen VP2.
Vector tách dòng l pCR2.1-TOPO, tế bo
E. coli chủng DH-5T1 (Invitrogen) đợc sử
dụng để nhân dòng. Các bộ kit tách DNA
của plasmid tái tổ hợp v enzym hạn chế
EcoRI, đợc dùng để cắt DNA plasmid kiểm
tra sản phẩm.
2.2. Tách chiết RNA tổng số
Mẫu bệnh phẩm l túi Fabricius đợc
nghiền trong nitơ lỏng nhằm tách các tế
bo riêng biệt. Thêm nớc muối sinh lý
theo tỷ lệ 1:1, đông tan 3 lần ở -20
o
C v
nhiệt độ phòng (25
o
C), nhằm giải phóng
virus khỏi tế bo. Ly tâm 8000 vòng/phút
trong 5 phút, thu dịch nổi phía trên có
chứa virus.
Bộ sinh phẩm sử dụng để tách RNA
tổng số l QIAamp Viral Mini Kit
(QIAGEN), theo hớng dẫn của nh sản
xuất. Tóm tắt các bớc nh sau: Lấy 140l

CCGGTCGACTACRGGATTCTGGGGCAC
CTG 3) (có điểm cắt SalI).
Ton bộ gen kháng nguyên VP2 đợc
nhân lên bằng RT-PCR từ nguồn khuôn
RNA tổng số, với chu trình nhiệt: 50
o
C/30
phút, 95
o
C/15 phút, 35 chu kỳ [94
o
C/15
giây, 65
o
C/35 giây, 72
o
C/90 giây], 72
o
C/8
phút. Sản phẩm cuối cùng l ton bộ VP2
có độ di khoảng 1,35 kb.
2.4. Tinh sạch v tách dòng sản phẩm
Sản phẩm RT-PCR đợc tinh sạch
bằng QIAquick Purification kit (QIAGEN).
Vắn tắt nh sau: Bổ sung 5 lần thể tích
dung dịch PB vo sản phẩm PCR, trộn
đều, rồi chuyển sang cột lọc, ly tâm 13000
vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang
ống ly tâm mới, bổ sung 750 l đệm PE, ly
tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

1997) v xây dựng phả hệ bằng chơng
trình Mega4.0 (Tamura et al. 2007). Thnh
phần axít amin đợc thu nhận bằng cách
sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi
khuẩn) trong Ngân hng gen thông qua
chơng trình GENEDOC 2.5.
3. KếT QUả V THảO LUậN
3.1. Kết quả tách RNA tổng số, thu
nhận gen kháng nguyên VP2 v
tách dòng sản phẩm
RNA tổng số của mẫu bệnh phẩm đợc
tách chiết theo qui trình đã trình by, đợc
điện di trên thạch agarose 0,8% (Hình 1A).
Trên thạch agarose, RNA tổng số hiển thị
l một vệt trắng sáng, với hm lợng tơng
đối cao để lm khuôn cho phản ứng RT-
PCR. Sử cặp mồi GKZF-SALGR, đoạn DNA
của ton bộ gen kháng nguyên VP2 có độ
di khoảng 1,35 kp đã đợc thu nhận (Hình
1B). Đoạn gen kháng nguyên VP2 sau khi
nhân lên, đợc gắn vo vector tách dòng
pCR2.1-TOPO để tạo plasmid tái tổ hợp.
Các plasmid tái tổ hợp ny đợc biến nạp
vo tế bo E. coli chủng DH-5T1. Các
khuẩn lạc trắng có khả năng chứa plasmid
tái tổ hợp của chủng GPT; BDG23 đợc
chọn lọc v nuôi cấy để tách DNA plasmid.
Sau khi tinh sạch các plasmid đợc cắt
bằng enzym giới hạn EcoRI để kiểm tra
đoạn chèn VP2 (Hình 1C).

2,0 kb
0,54 kb
3,9 kb
M 1 2 3 4 5 6
C
M 1 2
M 1 2
0,54 kb
4,4 kb
2,3 kb
2,0 kb
1,35 kb
A B
M 1 2
M 1 2
0,54 kb
4,4 kb
2,3 kb
2,0 kb
1,35 kb
A B
1,35 k
b
4,4 kb
2,3 kb
2,0 kb
0,54 kb
3,9 kb
M 1 2 3 4 5 6
1,35 k

đang chuyển đổi nhợc độc hóa (theo chiều
yếu dần) (Lê Thanh Hòa, 2003) ở dạng
trung gian, chứng tỏ chủng BDG23 l một
chủng có độc lực yếu. Chủng GPT ở vị trí
tơng ứng ny l A - I - Q - I - D - A - I - S -
A, chỉ khác duy nhất một axít amin ở vị trí
279 (D - I), chứng tỏ GPT l một chủng
cờng độc (Jackwood and Sommer-
Wagner, 2007) (Bảng 1).
Bảng 1. Biến đổi axít amin của các chủng nghiên cứu tại các vị trí epitope trong VP2
V trớ epitope cú bin i axớt amin
Cỏc chng so sỏnh
222 242 253 256 279 284 294 299 329
BDG23 P V Q V D A I N A
GPT A V Q I D A I S A
BDG A V Q I D A I S A
GHUT1 A V Q I D A I S A
GT1ST A V Q I D A I S A
GSG4 P V Q V D A I N A
52-70 P V Q V D A L N A
D78 P V H V D T L N A
Gvx2512 P V Q V D A I N A
GvxBL P V Q V D A I N A
HK46 A V Q I D A I S A
SH92 A V Q I D A I S A
JD1 P V H V D T L N A
OKYM A V Q I D A I S A
Cng c A I Q I D A I S A
c lc yu P/T V Q V D/N A L N R
Vacxin P V H V N T L N R

- Khi so sánh với các chủng BDG,
GHUT1, GT1ST, sai khác 6 axít amin
trong đó có hai vị trí khung epitope 222 v
229 (Bảng 1).
- So sánh với các chủng HK46 (Hồng
Kông), SH92 (Hn Quốc), JD1 (Trung
Quốc), OKYM (Nhật Bản) có đến 7 axít
amin sai khác trong đó có hai vị trí khung
epitope 222 v 229.
- So với các chủng cờng độc của Mỹ
(52/70, D78), có 4 v 7 axít amin của mỗi
chủng.
- Khi so sánh với các chủng vacxin của
Mỹ (đó l: Gvx2512, GvxBL), chỉ sai khác
1 v 2 axít amin của mỗi chủng.
- Đối với chủng GSG4 (Việt Nam), có
sai khác 6 axít amin.
Nh vậy chủng BDG23 đã có sự sai
khác về thnh phần khung epitope kháng
nguyên so với các chủng châu á bao gồm
các chủng GPT, BDG, GHUT1, GT1ST
của Việt Nam v các chủng HK46 (Hồng
Kông), SH92 (Hn Quốc), JD1 (Trung
Quốc), OKYM (Nhật Bản), chứng tỏ
chủng ny không giống với các chủng có
nguồn gốc châu á. Trong khi đó, cùng với
một chủng khác phân lập tại Việt Nam
(chủng GSG4), BDG23 không có sự sai
khác về thnh phần khung epitope khi so
sánh với các chủng cờng độc v vacxin

BDG : S F : 115
GHUT1 : S F : 115
GT1ST : S F : 115
GSG4 : S F A A : 115
52-70 : S F : 115
D78 : S F : 115
Gvx2512 : F : 115
GvxBL : S F : 115
HK46 : S S F : 115
SH92 : S F : 115
JD1 : S F : 115
OKYM : S F : 115

120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 *
BDG23 : GVYALNGTINAVTFQGSLSELTDVSYNGLMSATANINDKIGNVLVGEGVTVLSLPTSYDLGYVRLGDPIPAIGLDPKMVATCDSSDRPRIYTITAADDYQFLSQYQPGGVTITLF : 230
GPT : E S A : 230
BDG : S A : 230
GHUT1 : S A : 230
GT1ST : S A : 230
GSG4 : S V : 230
52-70 : S : 230
D78 : S : 230
Gvx2512 : : 230
GvxBL : : 230
HK46 : S A : 230
SH92 : S A : 230
JD1 : S : 230
OKYM : S A : 230

240 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340


A
MINO ACID VP2
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 *
BDG23 : MTNLQDQTQQIVPFIRSLLMPTTGPAPIPDDTLEKHTLRSETSTYNLTVGDTGSGLIVFSPGFPGSIVGAHYTLQSNGNYKFDQMLLTAQNLPASYNYCRLVSRSLTVRSSTLPG : 115
GPT : S F P G : 115
BDG : S F : 115
GHUT1 : S F : 115
GT1ST : S F : 115
GSG4 : S F A A : 115
52-70 : S F : 115
D78 : S F : 115
Gvx2512 : F : 115
GvxBL : S F : 115
HK46 : S S F : 115
SH92 : S F : 115
JD1 : S F : 115
OKYM : S F : 115

120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 *
BDG23 : GVYALNGTINAVTFQGSLSELTDVSYNGLMSATANINDKIGNVLVGEGVTVLSLPTSYDLGYVRLGDPIPAIGLDPKMVATCDSSDRPRIYTITAADDYQFLSQYQPGGVTITLF : 230
GPT : E S A : 230
BDG : S A : 230
GHUT1 : S A : 230
GT1ST : S A : 230
GSG4 : S V : 230
52-70 : S : 230
D78 : S : 230
Gvx2512 : : 230
GvxBL : : 230

Gvx2512 : : 453
GvxBL : : 453
HK46 : : 453
SH92 : : 453
JD1 : : 453
OKYM : : 453

Lờ Th Kim Xuyn, Lờ Thanh Ho
442
3.4. Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ
Chuỗi nucleotit v axít amin của chủng
BDG23 v GPT cùng với tất cả các chuỗi
chúng tôi dùng để so sánh (gồm 14 chủng)
đợc sắp xếp bằng GENEDOC2.5 (Nicholas
and Nicholas, 1997) v đa vo phân tích
phả hệ bằng chơng trình MEGA4.0
(Tamura et al. 2007). Kết quả đợc trình
by ở hình 3 cho thấy, các chủng phân chia
thnh 2 nhóm rõ rệt, trong đó, chủng GPT
(Việt Nam) cùng nhóm với các chủng châu
á, chủng BDG23 v chủng SGS4 (Việt
Nam) cùng nhóm với các chủng châu Âu-
Mỹ, kể cả phân tích thnh phần nucleotit
cũng nh axít amin. Kết quả phân tích phả
hệ v nguồn gốc một lần nữa khẳng định sự
hỗn hợp các dòng/chủng có nguồn gốc khác
nhau của virus Gumboro tại Việt Nam.
Những chủng có nguồn gốc ngoại lai, rất có
thể l các chủng đợc đa từ bên ngoi vo
nớc ta bằng nhiều con đờng khác nhau.

GPT tại Việt Nam v thu nhận ton bộ
gen VP2 của 2 chủng ny, bao gồm 1359
nucleotit tơng ứng với 453 axít amin.
Kết quả phân tích tơng đồng thnh
phần nucleotit v axít amin cho thấy,
chủng BDG23 có thể l một chủng thuộc
nhóm có độc lực yếu, trong khi đó chủng
GPT có thể l chủng cờng độc.
Chủng GPT cùng nhóm với các chủng
châu á, trong khi đó chủng BDG23 v
GSG4 cùng nhóm với các chủng châu Âu -
Mỹ khi phân tích tơng đồng thnh phần
nucleotit v axít amin cũng nh phân tích
phả hệ nguồn gốc.
Lời cảm ơn
Công trình nghiên cứu ny đợc thực
hiện nhờ ti trợ kinh phí của Bộ Khoa học
v Công nghệ cho đề ti KC.04.29 do
PGS.TS Lê Thanh Ho chủ nhiệm.
Ti liệu tham khảo
Becht H., H. Miller and K. Muller (1988).
Comparative studies on structural and
99
100
99
99
99
99
99
100

HK46
OKYM
SH92
BDG
GT1ST
GHUT1
0.002
CHU M
AMINO ACID
GSG4
GvxBL
Gvx2512
BDG23
D78
JD1
52-70
SH92
OKYM
HK46
BDG
GT1ST
GPT
GHUT1
0.005
CHU M
CHU
NUCLEOTIDE
GSG4
GvxBL
Gvx2512

GSG4
GvxBL
52-70
D78
JD1
HK46
OKYM
SH92
BDG
GT1ST
GPT
GHUT1
0.002
AMINO ACID
CHU
99
100
99
99
99
99
99
100
100
100
100
100
100
99
100

CHU M
AMINO ACID
GSG4
GvxBL
Gvx2512
BDG23
D78
JD1
52-70
SH92
OKYM
HK46
BDG
GT1ST
GPT
GHUT1
0.005
CHU M
CHU
NUCLEOTIDE
GSG4
GvxBL
Gvx2512
BDG23
D78
JD1
52-70
SH92
OKYM
HK46

SH92
BDG
GT1ST
GPT
GHUT1
0.002
AMINO ACID
CHU
Phỏt hin cỏc chng cng c Gumboro
443
antigenic properties of two serotypes of
infectious bursal disease virus. J. Gen.
Virol., 69, p. 631-640
Boot H.J., A.H. Ter Huurne and B.P.
Peeters (2000). Generation of full-length
cDNA of the two genomic dsRNA
segments of infectious bursal disease
virus. J. Virol. Methods, 84, p. 49-58.
Fahey K.J , K. Erny and J. Crooks (1989).

A conformational immunogen on VP2 of
infectious bursal disease virus that
induces virus-neutralizing antibodies
that passively protect chickens. Journal
of General Virology, 70, p. 1473-1481.
Jackwood D.J. and S. Sommer-Wagner
(2007). Genetic characteristics of infectious
bursal disease viruses from four
continents. Virology, 365, p. 369-375.
Lê Thanh Ho (2003). Sinh học phân tử

đoạn A) của virus cờng độc Gumboro
chủng GHUT-12 của Việt Nam. Tạp chí
Công nghệ Sinh học, Số 4, Tập 2, tr.
171-178.
Nicholas K.B. and H.B. Nicholas (1997).
Genedoc: a tool for editing and
annotating multiple sequence
alignments. Distributed by the author.
Sambrook J. and D.W. Russell (2001).
Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. 3rd Edition, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY.
Scherbacova L.O., A.L. Lomakin, A.V.
Borisov, V.V. Drygin and A.A. Gusev
(1998). Comparative analysis of VP2
gene variable region of infectious bursal
disease virus. Mol. Gen. Microbiol.
Virol., 1, p. 35-40.
Tamura K., J. Dudley, M. Nei and S.
Kumar (2007). MEGA4: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)
software version 4.0. ., 24, p. 1596-1599.