ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN PHƯỚC MINH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH
ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ
THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC
GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI
Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
Tp. Hồ Chí Minh năm 2012
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa -
ĐHQG-HCM
Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trần Bích Lam
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Trọng Giao
Phản biện độc lập 1:……………………………………………………
Phản biện độc lập 2:……………………………………………………
Phản biện 1:…………………………………………………………….
Phản biện 2:…………………………………………………………….
Phản biện 3:…………………………………………………………….
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại:
……………………………………………………………
………………………………………………………………
vào lúc giờ ngày tháng năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học tổng hợp Tp. HCM
- Thư viện Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyen Phuoc Minh et al., “Simultaneous determination of
erythromycin A in giant prawn and tilapia in Mekong region by
stripping square wave voltammetry,” European Journal of Food

v.v thì dư lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phải
nhỏ hơn 30 ppb. Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của
Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộc
nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép là
200 ppb. Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh
này trong các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS. Mục tiêu và nội
dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được phương pháp phân tích dư lượng
kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy và
tính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin.
Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trình
đào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu
hoạch trên đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi. Vậy nên trong đề tài này em
sẽ tiến hành nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycin
trong cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra quy luật và ước lượng
được thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn.
Từ hai yêu cầu trên, em đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng
kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét
nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải”.
2
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất
xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóng
vuông quét nhanh trên cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm
quốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phí
phân tích.
Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ
thịt thủy sản (tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật về
thời gian thu hoạch an toàn khi sử dụng erythromycin.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
 Ý nghĩa khoa học:

có phương tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường,
hóa chất, tôm cá trong quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra các
sản phẩm có uy tín quốc tế.
3. Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới
sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém
để phân tích nhiều kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khác
nhau nhằm giúp các địa phương tự giám sát tốt vấn đề này.
4. Rút ra được quy luật đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ
thịt tôm càng xanh và cá rô phi sau khi ăn thức ăn có trộn
erythromycin, từ đó ước lượng thời gian ngưng thuốc an toàn, góp
phần có được một nền công nghiệp chế biến thực phẩm chủ động, an
toàn và bền vững.
4
CHƯƠNG I TỔNG QUAN
Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B,
C, D, E, F. Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythrea bằng con
đường lên men. Sản phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin
A, còn lại là các erythromycin khác (≤ 5%). Erythromycin gồm 2 phân tử
đường gồm desosamin và cladinose gắn vào Erythronolide. Nó dễ dàng hút
ẩm và tan ít trong nước (0,2%). Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là
pH trung tính và không bền ở pH acid.
Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+]
và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã kháng
lại Penicillin. Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria,
Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella,
Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin. Erythromycin được
sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật.
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin
Nguyên lý của cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt
chậm và stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Nhúng

pháp Von-ampe để định lượng erythromycin mà chủ yếu là các phương
pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đặc biệt chưa thấy một công trình nghiên
cứu nào dùng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng để
định lượng erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô phi.
Một số công trình nghiên cứu về khả năng đào thải, chuyển hóa
erythromycin trên một số loài thủy sản như: Esposito cùng cộng sự
(2006) nghiên cứu quá trình đào thải erythromycin trên cá hồi vân dòng
Oncorhynchus mykiss. Moffitt cùng cộng sự (1988) đã nghiên cứu sự tích
6
lũy và đào thải của erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchus
tshawytscha. Moffitt cùng cộng sự (1999) tiến hành nghiên cứu độc tính,
khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mg
erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày
tiêm 1 lần và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục. Moffitt và cộng sự
(2001) kiểm tra tính độc cấp tính và độc mãn tính của erythromycin trên cá
hồi Oncorhynchus tshawytscha ở 2 nhiệt độ nước khác nhau. Haukenes và
cộng sự (2002) tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi cái Oncorhynchus
tshawytscha trước khi đẻ trứng. Fairgrieve và cộng sự (2005) cho cá hồi
Oncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn có chứa azithromycin (30 mg/kg cá
trong 14 ngày) hoặc erythromycin (100 mg/kg cá trong 28 ngày).
Tóm lại, những nghiên cứu trước về biến đổi của erythromycin trên
cơ thể thủy sản chủ yếu mới tập trung trên đối tượng cá hồi, là cá nước lạnh
và cũng chỉ mới dừng lại ở việc theo dõi sự đào thải erythromycin ở cá.
Chưa có báo cáo về erythromycin trên thủy sản nhiệt đới và cũng chưa có
báo cáo nào cho biết trong cơ thể thủy sản erythromycin sẽ chuyển hóa thế
nào, vì vậy đây sẽ là những nội dung mà đề tài này nghiên cứu.
Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm
càng xanh và cá rô phi: Đây là hai loại thủy sản được nuôi rất phổ biến ở
Việt Nam và có sử dụng erythromycin. Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh trên
tôm càng xanh bao gồm protozoans như Epistylis, Zoothamnium, và

Nội dung thứ II: Theo dõi quá trình đào thải và chuyển hoá
erythromycin theo thời gian khi kháng sinh này đi vào cơ thể tôm càng
xanh và cá rô phi bằng con đường thức ăn. Từ đó rút ra quy luật thời gian
ngưng thuốc an toàn trước thu hoạch.
2.2.2 Phương pháp thực nghiệm
2.2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc định lượng erythromycin
trên thiết bị Analyzer SQF - 505
8
 Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền: Amoni axetat, Natri
axetat, Borax, Tris, Citrat - phosphat
 Khảo sát nồng độ dung dịch nền: 0,05  0,25 M.
 Khảo sát dung môi hòa tan erythromycin: Methanol, Ethyl axetat,
Acetonitril.
 Nghiên cứu kỹ thuật đo Stripping SWV: chiều quét, V
start
, V
step
, V
pulse
,
T
drop
, V
electrolise
, T
electrolise
 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu: các ion vô cơ.
 Xây dựng đường chuẩn trong khoảng 50  900 ppb.
 Lựa chọn quy trình trích ly mẫu: sử dụng cột chiết pha rắn để tách loại
tạp và làm giàu erythromycin.

oxy, khí độc, lượng thức ăn cho ăn, kích cỡ tôm khi xử lý kháng sinh,
kháng sinh nguyên liệu, sàng lọc các dạng erythromycin B, C, D, E, F có
trong nguyên liệu erythromycin base này. Thời gian xử lý kháng sinh, con
đường đưa kháng sinh vào cơ thể, liều kháng sinh xử lý, số lần cho ăn thức
ăn trong ngày cũng được giám sát hết sức chặt chẽ. Mẫu được phân tích
khẳng định dư lượng erythromycin A, phân tích sàng lọc các dạng chuyển
hóa của erythromycin như erythromycin B, C, D, E, F theo phương pháp
LC-MS/MS thông qua Cty kiểm nghiệm TUV Rheinland Aimex Vietnam.
2.2.3 Xử lý số liệu
Tất cả số liệu phân tích đều được xử lý thống kê bằng phần mềm
Statgraphics và WT14.
10
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO VIỆC ĐỊNH
LƯỢNG ERYTHROMYCIN
3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét thế và chiều
quét thế
Erythromycin khá dễ tan trong nước nên các dung dịch nền dùng
cho người cứu chủ yếu là dung dịch nước với các chất điện ly khác nhau.
Trong công thức cấu tạo của erythromycin có nhóm C=O liên kết với một
nguyên tử oxy khác, ngoài ra có một số dị vòng chứa oxy được liên kết một
nguyên tử oxy nữa nên có thể dự đoán sẽ xuất hiện những sóng khử trong
khoảng thế từ -1,0 V đến -1,7 V. Vì thế em sẽ tập trung nghiên cứu ở vùng
thế này.
Qua thăm dò sơ bộ em thấy có một vài sóng trong khoảng thế này,
nhưng sóng ở thế vùng khoảng -1,4 V là tốt nhất đối với mục đích phân tích
định lượng, nên các khảo sát tiếp theo em tập trung để tìm điều kiện tối ưu
cho sóng này.
3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH phù hợp
Cường độ dòng của erythromycin bị ảnh hưởng bởi loại dung dịch

xuôi (0 đến -1.800 mV) cho đỉnh peak cao và đẹp. Trong khi đó, chiều quét
ngược (-1.800 mV đến 0) không thể hiện đỉnh peak. Chiều quét xuôi (0 đến
-1.800 mV) được chọn để khảo sát các thông số tiếp theo. Điều này nói lên
rằng tính chất không thuận nghịch của erythromycin khi quét.
3.1.5.2 Nghiên cứu chọn thế bắt đầu ghi phổ V
start
Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch
nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các giá trị thế bắt đầu ghi phổ V
start
khác nhau và thu được các kết quả sau:
150,0
170,0
190,0
210,0
230,0
250,0
270,0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Nồng độ dung dịch nền ammonium acetate (M)
Cường độ dòng erythromycin A
(nA)
12
Hình 3.13: Ảnh hưởng của V
start
đến cường độ dòng của erythromycin A
3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước thế 1 chiều V
step
Tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong
dung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 một số tốc độ quét thế một chiều
tương ứng với thế bước V

180
190
200
210
220
4 6 8 10 12
Vstep (mV)
Cường độ dòng erythromycin
A (nA)
y = 15,258x + 78,47
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50
Vpulse (mV)
Cường độ dòng erythromycin
A (nA)
13
3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét thế trong đời sống 1 giọt thủy
ngân T
drop
Giá trị T
drop
này thể hiện thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểm
hình thành một giọt thủy ngân mới. Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị

Cường độ dòng erythromycin
A (nA)
y = 181,7x + 815,2
1300
1350
1400
1450
1500
1550
1600
1650
1700
1750
1800
2 3 4 5 6
Telectrolise (s)
Cường độ dòng erythromycin
A (nA)
14
Hình 3.23: Ảnh hưởng của V
electrolise
đến cường độ dòng của erythromycin A
3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion vô cơ Na
+
, K
+
, Ca
++
, Mg
++

-
, SO
4
2-
, HPO
4
2-
ảnh hưởng không đáng kể (<5%) đến cường
độ dòng của erythromycin.
3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 50  400 µg/kg với hệ số
tương quan điều chỉnh r
adjusted
= 1,0; LoD = 0,52 µg/kg.
Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0
3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu
Kết quả khảo sát này cho thấy trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô
phi thì quy trình trích ly III cho hiệu suất thu hồi erythromycin cao nhất
(90,59%, 83,57%) nên quy trình trích ly III được chọn để khảo sát các
thông số tiếp theo.
y = -0,2187x + 1620,8
1650
1700
1750
1800
1850
1900
-1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300
Velectrolise (mV)
Cường độ dòng erythromycin

84.00
86.00
88.00
90.00
92.00
Hiệu suất trích
ly (%)
I II III IV V
Quy trình trích ly
70.69
75.25
83.57
69.33
72.34
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
Hiệu suất
trích ly (%)
I II III IV V
Quy trình trích ly
16
Bảng 1.16 (phụ lục): Độ chính xác (RSD %), độ đúng (RE %) và hiệu suất thu hồi

1,57
90,92
1
200
187,23 ± 2,79
b
1,49
93,61
2
200
184,76 ± 1,97
b
1,07
92,38
3
200
185,18 ± 2,43
b
1,31
92,59
1
300
286,03 ± 4,01
c
1,40
95,34
2
300
288,27 ± 2,71
cd

2
100
85,34 ± 1.79
a
2,10
85,34
3
100
85,31 ± 1.24
a
1,45
85,31
1
200
173,25 ± 2.34
b
1,35
86,63
2
200
173,03 ± 2.09
b
1,21
86,51
3
200
172,82 ± 1.39
b
0,80
86,41

-1.430 mV
2
Chloramphenicol
-168 mV
3
Florfenicol
-78 mV
4
Furazolidone
-1.152 mV
5
Ciprofloxacin
-1.336 mV
6
Enrofoxacin
-214 mV
7
Danofoxacin
-1.120 mV
Sự tách biệt thế bán sóng này chứng tỏ được phương pháp stripping
sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ngoài khả năng sàng lọc mà còn
có khả năng nhận danh và tính khẳng định.
 Giải thích cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin:
Trong công thức cấu tạo của eythromycin (hình 3.1) có hai nhóm
C=O, đó là cơ sở để hy vọng có thể bắt được tín hiệu khử đặc trưng của
eythromycin. Các nhóm C=O, như trong các aldehyde và xeton, thường cho
sóng khử trực tiếp theo cơ chế sau:
 Trong giai đoạn thứ nhất xảy ra phản ứng khử thuận nghịch với sự
tham gia một điện tử để tạo ra gốc anion:
RR’C=O + e

1/2
= -1,93 V
Đệm pH 9 E
1/2
= -2,08 V
 Propionaldehyde CH
3
–CH
2
–CH=O LiOH 0,1M E
1/2
= -1,96 V
Qua các ví dụ trên ta thấy khi nguyên tử cacbon của nhóm C=O
liên kết với các mạch cacbon càng dài, mật độ điện tử trong nhóm C=O
càng cao, quá trình khử càng khó, thế bán sóng càng tăng về phía âm.
Ngược lại khi các nhóm ái điện tử càng gần nguyên tử cacbon của nhóm
C=O, thì nhóm C=O càng dễ khử như các ví dụ sau:
 Methylglyoxal CH
3
–CO–CH=O Đệm pH 7 E
1/2
= -1,36 V
 Glycoaldehyde HO–CH
2
–CH=O Đệm pH 7 E
1/2
= -1,54 V
Nhóm C=O thứ nhất của erythromycin liên kết với một loạt nhóm
CH và CH
3

và dung môi sử
dụng. Tuỳ thuộc pH dung dịch nền, nhóm này cho 1 sóng hay 2 sóng khử.
b) Họ Nitrofuran:
Trong họ kháng sinh nitrofuran có 3 nhóm chức điện hoá:
- Nhóm NO
2
có E
1/2
trong khoảng - 0,2 V đến - 1,0 V.
- Nhóm C=N có E
1/2
trong khoảng -1,0 V đến - 1,8 V.
19
- Ngoài ra còn có nhân dị vòng 2-oxo-1,3-oxolidin cũng có thể tham gia
phản ứng khử.
c) Họ Fluoroquinolon:
Nhóm fluoroquinolon trong công thức cấu tạo có khung quinolon,
nhân quinon, nhóm này có phản ứng khử trên điện cực giọt thuỷ ngân.
3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SSWV với LC-MS/MS
3.2.5.1 Trên mẫu tôm càng xanh
Hiệu suất thu hồi: > 90,92 %, MDL: 0,57 µg.kg
-1
; R_adjust:
0,99999; RSD: 0,91  1,58 %. (Hình 3.29)
Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh
3.2.5.2 Trên mẫu cá rô phi
Hiệu suất thu hồi: > 85,07%; MDL: 0,80 µg.kg
-1
; R_adjust: 1,0;
RSD: 0,80  2,10 % (Hình 3.30).

RSD
(%)
GP – Blank
KPH
KPH
GP – Blank
KPH
KPH
GP – Blank
KPH
KPH
GP – I
51,37
50,75 ± 0,59
a
1,17
50,73
52,61 ± 3,72
a
7,06
GP – I
50,19
56,89
GP – I
50,68
50,21
GP – II
65,45
65,48 ± 0,53
b

SSWV (LOD=0,80 µg*kg
-1
)
LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg
-1
)
Dư lượng
(mg*kg
-1
)
TB ± SD
(mg*kg
-1
)
RSD
(%)
Dư lượng
(mg*kg
-1
)
TB ± SD
(mg*kg
-1
)
RSD
(%)
TL – Blank
KPH
KPH
TL – Blank

2,09
2,72
TL – II
2,02
2,29
TL – III
2,80
2,78 ± 0,03
c
1,25
2,80
2,80 ± 0,01
b
0,21
TL – III
2,80
2,80
TL – III
2,74
2,81
* LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát hiện
Qua bảng 3.4 và 3.5, cũng như kết quả phân tích ANOVA ở bảng
3.28-3.31 (phần phụ lục) ta thấy được có sự tương đồng khá chặt chẽ về kết
quả phân tích giữa 2 phương pháp SSWV và LC-MS/MS. Xét về độ lặp lại
của phương pháp thì phương pháp sóng vuông quét nhanh có độ lặp lại tốt
21
hơn phương pháp LC-MS/MS dựa trên chỉ số % R.S.D trên cả 2 đối tượng
mẫu là tôm càng xanh và cá rô phi.
3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ERYTHROMYCIN TRÊN CÁC MẪU THỰC
TẾ TÔM, CÁ TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG

Long Ho
Mo Cay
Chau Thanh
Giong Trom
Duyen Hai
Tra Cu
Cang Long
Phung Hiep
Long My
Vi Thuy
My Tu
My Xuyen
Ke Sach
Vinh Thanh
O Mon
Co Do
Phuoc Long
Hong Dan
Gia Rai
Dong
thap
Kien
Giang
An
Giang
Vinh
Long
Ben
Tre
Tra

Phu Tan
Tam Binh
Binh Minh
Long Ho
Mo Cay
Chau Thanh
Giong Trom
Duyen Hai
Tra Cu
Cang Long
Phung Hiep
Long My
Vi Thuy
My Tu
My Xuyen
Ke Sach
Vinh Thanh
O Mon
Co Do
Phuoc Long
Hong Dan
Gia Rai
Dong
thap
Kien
Giang
An
Giang
Vinh
Long

C) đối với tôm càng
xanh đã được cho ăn erythromycin 100 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
trong thời
gian 7 ngày. Riêng với mức nồng độ 50 mg.kg
-1
thể trọng.ngày
-1
trong thời
gian 7 ngày thì dư lượng để lại là không đáng kể và ở mức an toàn.
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
0 100 200 300 400 500 600 700
Thời gian (
o
C - ngày)
Erythromycin A (µg/kg)
50 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày
0
5,000
10,000
15,000