Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 1
Mục lục
LỜI NÓI ĐẦU 3
I. TỔNG QUAN: 4
1. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: 4
1.1. Cấu trúc bậc 1: 4
1.2. Cấu trúc bậc 2: 5
1.3. Cấu trúc bậc 3: 6
1.4. Cấu trúc bậc 4: 6
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 7
1. ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 7
1.1. Đònh lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 7
1.2. Đònh lượng nitơ phi Protein: 12
1.3. Đònh lượng Protein trong nguyên liệu: 13
2. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 13
2.1. Đònh lượng Protein theo phương pháp Biure. 13
2.2. Đònh lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): 16
2.3. Đònh lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant
Blue G - 250): 19
3. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID
(BCA): 22
3.1. Nguyên tắc: 22
3.2. Cách tiến hành: 22
3.3. Tính kết quả: 22
3.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 22
4. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 23
4.1. Nguyên tắc: 23
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 3 L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
IN
N
O
O
Ù
Ù
I
IĐ
Đ
A

I
.
.T
T
o
o
å
å
n
n
g
gq
q
u
u
a
a
n
n
:
:1

a
â
â
n
nt
t
ư
ư
û
ûP
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n
:
t
t
r
r
u
u
ù
ù
c
cb
b
a
a
ä
ä
c
c1
1
:
:
O
–

Liên kết peptide
H H H O H H H O H
– HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C –
R
1
O R
2
H R
3
O R
4
H R
5Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 5
1
1
.
.
2
2
.
.

c
c2
2
:
:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch
polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch
polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành
giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác đònh.

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 6 1
1
.
.
3
3
.

ä
c
c3
3
:
:

Tương tác không gian giữa các gốc
acid amin ở xa nhau trong mạch
polypeptide, là dạng cuộn lại trong không
gian của mạch polypeptide (hình dạng
chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều
protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự
tạo thành các liên kết disunfua giữa các
gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide,
làm cho mạch bò cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên
kết tónh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin … đều tham
gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình
tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần
thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.
1
1
.
.

a
a
ä
ä
c
c4
4
:
:

Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu,
tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 7
polypeptide gọi là”phần dưới đơn vò ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực
Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vò”.
I
I
I
I
.
.

a
a
ù
ù
p
pđ
đ
ò
ò
n
n
h
hl
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g

h
hl
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
gn
n
i
i
t
t
ơ
ơt
t

p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù
p
pK
K
j
j

.
.Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
hl
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
gN
N

h
h
e
e
o
op
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù

e
e
â
â
n
nt
t
a
a
é
é
c
c
:
:

Quá trình gồm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte)
nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H
2
SO
4
thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bò
phân hủy và bò oxi hóa đến CO

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 8
Lượng NH
3
sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một
erlen có chứa một lượng thừa H
2
SO
4
đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH
3
sẽ tác
dụng với H
2
SO
4
chuyển thành (NH
4
)
2
SO
4
.
NH
3
+ H
2
SO

C
a
a
ù
ù
c
c
h
ht
t
i
i
e
e
á
á
n
nh
h
a
a
ø
ø
n

3
2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96
o
, acid tricloacetic (TCA),
thuốc thử đỏ metyl.
 Thiết bò: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger.
(chen hình vào)
Quá trình được thực hiện qua các bước.
 Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO
2
,
CO
2
).
Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn
tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô
đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước
quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK
2
SO
4
/CuSO
4

(hoặc selen, hay H
2
O
2
30%, hay HCLO
4

và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dòch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu
mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dòch H
2
SO
4
0,01N của erlen E
Hút 10ml dung dòch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi
bình A, mở van 2 để dung dòch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất
vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 10
giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa
C một lần nữa với thao tác tương tự như trên.
Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy
xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp
tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B.
Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp
2 mà thôi.
Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu
mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của
ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xòt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài
lần như trên rồi chuẩn độ lượng H
2
SO
4
thừa bằng dung dòch chuẩn NaOH 0,01N.
 Bước 3: chuẩn độ
Lượng H
q
q
u
u
a
a
û
û
:
:Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau:
x là tỉ số giữa thể tích H
2
SO
4
0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ.
Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH.
Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức:
X=
 
01
* *0,0014*100*100
10*
v v x
m


 
4
1
1000
14* * *10 *
o
m
v v x
v



Trong đó: V
m
là thể tích mẫu
*Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H
2
SO
4
– H
3
BO
3
Sử dụng hệ chuẩn H
2
SO
4
– H
3
BO

tự phân li:
H
3
BO
3
 HBO
2
+ H
2
O
Khi cất đạm NH
3
bò kiềm đẩy khỏi (NH4)
2
SO
4
theo hệ thống sinh hàn vào
bình hứng, phản ứng với HBO
2
:
NH
4
OH + HBO
2
 NH
4
+
+ BO
2
-

2

Tính kết quả:
Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau:
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 12
*0,14 *100
(%)
*
t
m
VV
N
Vm
Trong đó: V
t
– lượng H
2
SO
4
0,01N để chuẩn độ

BO
2
-


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
gn
n
i
i
t
t
ơ
ơp
p
h
h
i

e
â
â
n
nt
t
a
a
é
é
c
c
:
:Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein.
Tuy nhiên trong dòch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các
chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút.
Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng,
acid, thẩm tích đối nước … Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau:
TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH
3
COO)
2
10 – 15%, CuSO
4

a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:Nguyên liệu: các mẫu cần được xác đònh hàm lượng phi Protein
Hóa chất: cồn 70
o
và các chất cần cho việc đònh lượng Protein theo phương
pháp Kjeldahl.
Cân chính xác 5 – 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ
hay thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70
o
(tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu
tươi và 1:8 nếu mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 – 80
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 13
phút và khuấy liên tục. Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã
vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70
o
một lần nữa

ơ
ï
ï
n
n
g
gP
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
nt
t
r
r
o

ä
u
u
:
:Có thể tiến hành theo 2 cách sau:
cách 1: xác đònh trực tiếp
Xác đònh hàm lượng ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết
quả nhân với 6,25.
Protein = Nitơ
Protein
* 6,25
Cách 2: xác đònh gián tiếp
Nitơ
tổng số
= Nitơ
Protein
+ Nitơ
phi Protein

Ta xác đònh nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau
đó tính nitơ Protein.
Nitơ
Protein
= Nitơ
tổng số
- Nitơ
phi Protein

g
gP
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
nb
b
a
a
è
è
n
n
g
g

o
om
m
a
a
ø
ø
u
u2
2
.
.
1
1
.
.Đ
Đ
ò
ò
n
n

n
nt
t
h
h
e
e
o
op
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p

y
y
e
e
â
â
n
nt
t
a
a
é
é
c
c
:
:Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu
2+
trong môi trường kiềm tạo
phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 14

h
a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:Chuẩn bò nguyên liệu và hóa chất: dung dòch Albumin tiêu chuẩn 1%
Chuẩn bò thuốc thử Biure:
Cân chính xác 1,5g CuSO
4

6g Tartrat Kilium và Natrium 500ml nước cất
Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và đònh mức đến 1000ml
Lập đồ thò chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
3
0,4
0,6
4
5

4
0,6
0,4
6
5

5
0,8
0,2
8
5

6
1,0
0,0
10
5 Bảng 3: lập đồ thò chuẩn nồng độ Protein
Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.
Chuẩn bò dung dòch nghiên cứu.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dòch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trò số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 16
Đ
Đ
o
o
ä
än
n
h
h
a
a
ï
ï
y
yv
v
a

ù
n
n
g
gd
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương
pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein
tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml.
2
2
.
.
2
2

r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
nb
b
a
a
è
è
n
n
g
gp
p
h
h

y
y(
(
B
B
i
i
u
u
r
r
e
ec
c
a
a
û
û
i
it
t

t
t
a
a
é
é
c
c
:
:Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử
dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc
tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại
ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dònh lượng hàm
lượng Protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein.

Hình : Phản ứng Lowry
T
T
i
i
e
e
á
á
n
n


.5H
2
O 0,5% pha trong dung dòch natri citrat 1%
 Dung dòch C : hỗn hợp dung dòch A và dung dòch B với tỉ lệ 49:1
 Dung dòch Folin
Cách pha dung dòch Folin: Pha trong bình cầu có V= 2l
Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na
2
WO
4
.2H
2
O) và 25g natri
molypdate ( Na
2
MoO
4
.2H
2
O). Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto
phosphoric 85% ( H
3
PO
4
) .Khuấy cho tan và thêm vào đó 100ml HCl đậm đặc và
tinh khiết rồi tiếp tục khuấy. Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu
trong 10h. Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150g lithium sulfat ( Li
2
SO
4

Nước cất
(ml)
Nồng độ
Protein
(mg/ml)
Dung dòch
C (ml)
Thuốc thử
Folin (ml)
OD
1
0,0
10
0
2
0,5

2
0,5
9,5
50
2
0,5

3
1,0
9,0
100
2
0,5

n
n
h
ht
t
o
o
a
a
ù
ù
n
n
:
:Từ bảng trên khi lập đồá thò thì ta lấy trò số mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ
đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dòch Protein
chuẩn, từ đó ta lập đồ thò biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ
Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ quang.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trò số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam
k
h
h
a
a
û
ûn
n
a
a
ê
ê
n
n
g
gư
ư
ù
ù
n
n
g
g


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
hl
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
gP
P
r
r
o
o

g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù
p
pB
B
r
r
a
a
d
d
f
f
o
o
r
r

i
i
l
l
l
l
i
i
a
a
n
n
t
tB
B
l
l
u
u
e
eG
G
n
nt
t
a
a
é
é
c
c
:
:Dựa phản ứng màu của Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant
Blue G - 250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi
trường axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương
tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein
làm dung dòch có màu xanh. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein trong dung
dòch. Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu.

Phản ứng cho màu Coomassie
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 20
T
T

C. Khi dùng pha loãng 100 lần để được dung dòch Albumin 0,1mg/ml.
Pha thuốc thử Bradford:
Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue và 4,7g Ethanol 99
o
và 8,5g Acid
Phosphoric 85%, đònh mức tới 100ml bằng nước cất. Đựng trong chai có nút đậy
kín.
Thiết bò: máy đo màu quang điện.
Tiến hành:
Lập đồ thò chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
ng số
Dung dòch Albumin
0.1mg/ml (ml)
Nước cất
(ml)
Nồng độ Albumin
(µg)
Thuốc thử
Bradford
(ml)
1
0
1
0
5
2
0,1
0,9
10

Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford
Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford
(Có thể thay nước cất bằng NaCl 0,15M)
Đem đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ
quang phải nằm trong khoảng của đường chuẩn).
T
T
í
í
n
n
h
ht
t
o
o
a
a
ù
ù
n
n
.
.Từ bảng trên thì ống 1 là ống đối chứng ,vì vậy khi lập đồá thò thì ta lấy trò số

a
ø
øk
k
h
h
a
a
û
ûn
n
a
a
ê
ê
n
n
g
gư
ư
ù

22
3
3
.
.Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
hl
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù
p
pd
d
u
u
ø

i
c
cA
A
c
c
i
i
d
d(
(
B
B
C
C
A
A
)
)
:
:3

é
c
c
:
:Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo
màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 562nm.

Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA)
Đầu tiên Protein sẽ khử Cu
2+
thành Cu
+
và tạo thành phức có màu xanh trong
môi trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu
+
được tạo ra ở trên
cho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm.
3
3
.
.
2
2
.
.
n
n
h
h
:
:Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử
Biure thành thuốc thử BCA.
3
3
.
.
3
3
.
.T
T
í
í
n
n
h
h
.Đ
Đ
o
o
ä
än
n
h
h
a
a
ï
ï
y
yv
v
a
a
ø
ø


gd
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện
Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg. Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 23
dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ
trong phân tử có các aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cũng bắt
màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả.
4
4
.
.

o
o
t
t
e
e
i
i
n
nb
b
a
a
è
è
n
n
g
gp
p
h
h
ư
ư
p
p
h
h
o
o
å
å4
4
.
.
1
1
.
.N
N
g
g
u
u
y
y

Hệ số tắt
Protein
Hệ số tắt
IgG
13,6
Chuỗi γ
13,7
Oncanavalin A
120
IgM
11,8
Chuỗi µ
13,9
Lactin Lens
Calinaris
12.5
IgA
13,2
Chuỗi 
12,3
BSA
6.7
IgD
15,3
Chuỗi nhẹ
12,3 Bảng 3: Hệ số tắt của các loại Protein liên quan với hệ miễn dòch ở bước sóng
280nm

n
nh
h
a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:Nguyên liệu: Dung dòch Protein để đo, đệm hòa tan Protein
Thiết bò: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng là 1cm
Quá trình gồm các bước sau:
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 24
Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong thể
huyền phù. Lấy dòch nổi để xác đònh mật độ quang học.
Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thụ
về 0 với cuvet chứa đệm.
Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu. Nếu giá trò thu được > 2,0 thì

á
t
tq
q
u
u
a
a
û
û
:
:Nồng độ Protein =
độ hấp thụ ở 280nm
hệ số tắt ở 280nm

Với một hỗn hợp các Protein hoặc với bất kỳ một loại Protein nào mà không
biết hệ số tắc thì tính như sau:
Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ ở 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ ở 260nm)
Đơn vò: mg/ml
Có thể phỏng đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu ở 280nm/độ hấp
thu ở 260nm).
4
4
.

a
ø
øk
k
h
h
a
a
û
ûn
n
a
a
ê
ê
n
n
g
gư
ư
ù

So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn,
mẫu dùng lại thường ổn đònh hóa phần lớn Protein.
5
5
.
.P
P
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù

O
O
-
-
P
P
h
h
t
t
h
h
a
a
l
l
a
a
l
l
d
d
e
e
h
h
y
y
d
d

g
g
u
u
y
y
e
e
â
â
n
nt
t
a
a
é
é
c
c
:
:Dựa vào phản ứng giữa O-Phthalaldehyde (OPA) với các amin có mặt trong
chuỗi polypeptide (từ đầu đến cuối mạch kể cả chính và phụ). Phản ứng xảy ra
nhanh trong sự có mặt của mercaptoethanol tạo sản phẩm huỳnh quang có màu
xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng 340nm -450nm.

v
v
a
a
ø
øk
k
h
h
a
a
û
ûn
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g
.P
P
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
gp
p
h
h
a
a
ù
ù
p
pđ

n
i
i
a
a
c
c6
6
.
.
1
1
.
.

N
N
g
g
u
u
y
y
e

+ Mg(OH)
2
2NH
3
+ 2H
2
0 + Mg
2+
2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4