1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
٭٭٭ 000٭٭٭

PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp.
carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY. HO CHI MINH CITY
DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp. carotovora ON
THE Cymbidium BY THE PCR Graduation thesis
Major: Biotechnology
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận.
Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006

Nguyễn Thị Thanh Hà

5

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN
(Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn:
Thầy Lê Đình Đôn
Thầy Dƣơng Thành Lam
Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích
Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan
(Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh
thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác
nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng
pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy
trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP.
Đà Lạt – Lâm Đồng.

Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – yêu cầu 1
1.2.1. Mục đích 1
1.2.2. Yêu cầu 1
1.2.3. Giới hạn 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc
nuôi trồng Cymbidium 3
2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium 3
2.2.1. Phân loại – phân bố 3
2.2.2. Đặc điểm thực vật học 4
2.2.3. Yêu cầu sinh thái 5
2.2.4. Sâu bệnh 5
2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt
và trên thế giới 7
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora và tác hại của nó 8
2.3.1. Phân loại 8
2.3.2. Erwinia carotovora 8
2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora 9
2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra 13
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

8

9
4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer
Erw1 và Erw2 35
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
5.1. Kết luận 37
5.2. Đề nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

10
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR : Polymerase chain reaction
DNA : Deoxyribonucleotide acid
RNAse : Ribonuclease
TE : Tris EDTA
SDS : Sodium dodecyl sulfate
NaCl : Natri clorua
TAE : Tris Acetate EDTA
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
Taq : Thermus aquaticus
UV : Ultra violet
LB : Luria – Bertani
KB : King et al. 's medium B agar
CVP : Crystal violet - pectate
PGA : Potato Glucose Agar
EtBr : Ethidium bromide
YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO

Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC
sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây
chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) 31
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan
chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 25
0
C) 32
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh
sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA 32
Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 33
Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 56
0
C) 34
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 58
0
C) 34
Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 35

12
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

BẢNG TRANG
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra 27

ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm

1.2.2. Yêu cầu
- Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng.
- Phân lập mẫu vi khuẩn.
- Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora.
- Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn.

14
- Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích
hợp để thiết lập quy trình PCR.
1.2.3. Giới hạn
- Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006.
- Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu.
- Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR.

15
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu Á với nhiều vùng tiểu khí hậu rất khác
nhau, là một trong những nơi tập trung nhiều loài lan của thế giới, đặc biệt là từ các vùng
cao nguyên Trung Bộ đến miền Đông Nam Bộ. Ở nƣớc ta vƣơng quốc thật sự của các loài
lan là những vùng cao nguyên có độ cao từ 800 m đến 1.000 m nhƣng đáng kể nhất vẫn là
ở Đà Lạt – Lâm Đồng.
Thành phố Đà Lạt đƣợc đặt trọn trên cao nguyên Lâm Viên với độ cao trên dƣới
1.500 m, về phía Đông Bắc tỉnh Lâm Đồng. Phía Bắc giáp huyện Lạc Dƣơng, phía Nam
giáp huyện Đức Trọng, phía Đông và Đông Nam giáp huyện Đơn Dƣơng, phía Tây và
Tây Nam giáp huyện Lâm Hà. Nhiệt độ trung bình năm là 18,3
0
C, biên độ nhiệt trong
ngày 11 – 12
0

con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ rễ củ.
Thân (căn hành): thân ngầm của chúng (căn hành) thƣờng ngắn, nối những củ lan
với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi
căn hành cũ, có thể mọc ra căn hành mới, từ đó mọc ra những cây con. Do đó mà ngƣời ta
xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân.
Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 –
15 cm. Củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá.
Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính
trên giả hành. Lá thực thƣờng có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách.
Khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành. Vài loài không có cuống lá. Tùy theo
từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá. Một số loài
ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng còn lại thƣờng xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá
thay đổi theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ƣa bóng
rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến. Đầu lá nhọn hay chia thành hai thùy.
Kích thƣớc của bản lá biến động từ 0,5 – 6 cm. Chiều dài lá thay đổi từ 10 – 150 cm.
Chồi hoa: thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già,
đâm ra bên ngoài. Thông thƣờng mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thƣờng xuất
hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn còn chồi thân hơi dẹp.

17
Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của
phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân
phiên theo đƣờng xoắn ốc.
Hoa: hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ
nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy), hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Quả lan là một nang
có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín quả mở theo 3 đƣờng góc và
gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện
ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia hạt sẽ nảy mầm phát triển thành
cây mới (Trƣơng Trỗ, 1988).
2.2.3. Yêu cầu sinh thái đối với Cymbidium

dạng bệnh này.
Virus làm khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thƣờng, lá trở nên dày hơn,
có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng.
Bệnh do virus không có thuốc đặc trị. Khi thấy trong vƣờn có những cây lan có
biểu hiện trên, cần phải cách ly để chăm sóc riêng nếu cây bị nhiễm nhẹ. Trong trƣờng
hợp cây bị nhiễm nặng cần phải đốt bỏ để tránh lây lan sang các cây khỏe mạnh. Phải khử
trùng dụng cụ sau mỗi lần tách chiết một cây và quan tâm đến công tác phòng trừ rầy rệp,
làm vệ sinh mặt chậu và vƣờn lan thƣờng xuyên.
Bệnh do vi khuẩn
Bệnh thối nâu: vết bệnh màu nâu nhạt, hình tròn, mọng nƣớc, về sau chuyển sang
màu nâu đen. Bệnh gây hại trên lá, thân, mầm gây nên hiện tƣợng thối (có mùi khó chịu).
Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra.
Bệnh thối mềm: vết bệnh có dạng bất định, ủng nƣớc, màu trắng đục, thƣờng lan
rộng theo chiều rộng của phiến lá. Trong điều kiện ẩm độ cao sẽ gây hiện tƣợng thối úng.
Trong điều kiện khô ráo, mô bệnh khô, teo tóp và có màu trắng xám. Nguyên nhân bệnh
do vi khuẩn Pseudomonas Glagioli gây ra.
Bệnh do nấm
Bệnh đen thân cây con: vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, có màu nâu, sau
đó lan dần làm khô đoạn thân gần gốc và cổ rễ, vết bệnh chuyển sang màu đen. Lá chuyển
sang màu vàng, cong dị hình. Cây con bị bệnh sau 2- 3 tuần, trong căn hành thƣờng có vệt
màu tím hay hồng nhạt. Nguyên nhân bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra.
Bệnh đốm lá: vết bệnh thƣờng có hình thoi hoặc hình tròn nhỏ màu xám nâu, xuất
hiện ở mặt dƣới lá. Bệnh làm vàng lá, dễ rụng, cây sinh trƣởng kém. Nguyên nhân bệnh
do nấm Cercospora sp. gây ra.
Bệnh thán thƣ: vết bệnh thƣờng có hình tròn nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từ mép
lá, chóp lá hoặc giữa phiến lá, kích thƣớc trung bình 3- 6 mm. Giữa vết bệnh hơi lõm có
màu trắng xám, xung quanh có gờ nhỏ màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều chấm nhỏ màu
đen. Nguyên nhân bệnh do nấm Colletotrichium gloeosrioides gây ra.

19

20
gia nhập khẩu hoa lan đứng đầu. Theo thống kê tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành
600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật chủ yếu là Dendrobium, Cymbidium. Thái
Lan là nƣớc xuất khẩu hoa lan đứng đầu thế giới, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới
với giá từ 3 – 5 USD/cành, có khi tới 80 – 100 USD/ cành, những giống quý có thể lên tới
hàng ngàn USD (Trích Lê Hữu Quang, 2005).
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó
2.3.1. Phân loại: Theo Winslow và ctv (1920), loài Erwinia thuộc:
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria
Lớp (Class) : - Proteobacteria
Bộ (Order) : Enterobacteriales
Họ (Family) : Enterobacteriaceae
Giống (Genus) : Erwinia (Nguồn: ). (Nguồn: )
Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, đƣợc chia thành 2
nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi
cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora”.
2.3.2. Erwinia carotovora
Erwinia carotovora là tác nhân gây ra bệnh thối mềm (soft rot), một bệnh rất nguy
hiểm và tàn phá cây trồng. Nhiều loại thực phẩm có giá trị kinh tế nhƣ khoai tây, cà chua,
cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hƣởng bởi bệnh này. Loài Erwinia carotovora là

C, tạo acid từ arabinose,
cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose,
inositol, manitol và sorbitol. Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn
không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và
malate. Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate,
nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không
(Fiori và Schiaffino, 2003).
Đƣờng lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đƣờng tự nhiên nhƣ
khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thƣơng gây ra bởi
côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002).

22
Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp. carotovora là tác nhân gây bệnh
cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tƣơng tác giữa nó với ký chủ và môi trƣờng.
Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc nhƣ
các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes). Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế
bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự
phát triển của bệnh. Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl),
polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây
hƣ hại tế bào và làm mô suy yếu. Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa
pectate lyase đã biết trình tự. Có 3 họ đã đƣợc xác định và giữa chúng có tính tƣơng đồng
cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia
chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia
chrysanthemi, nhóm thứ ba tƣơng ứng với gen đƣợc tìm thấy trên một vài dòng Erwinia
carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family). Cellulases hoạt động
trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết 1,4-β-D-
glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc. pH tối ƣu gần bằng 7,
cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ
cấp của cây trồng. Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác
cũng ảnh hƣởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ

– 90% nhà kính ở Mersin và Antakya. Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả
về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty
acid methyl ester) ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn
Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi
(Aysan và ctv).
Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra là
12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng tiêu (Capsicum annuum) tại St.
David
'
s, Ontario. Bệnh cũng đƣợc quan sát trên cánh đồng trồng tiêu gần Harrow năm
1996 – 1997. Đây là báo cáo đầu tiên về vi khuẩn gây thối thân (bacterial stem canker) tại
các nhà kính trồng tiêu ở Canada (Cerkauskas và Brown, 2001).

24
Ở New Zealand, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ những củ cala (Zantedeschia
spp. ) bị nhiễm bệnh đƣợc xác định là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Báo cáo
này cho thấy Erwinia carotovora subsp. carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối
mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998).
Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora
Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia
carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau.Với sự phát triển vƣợt
bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời nhƣ PCR (Polymerase Chain
Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã
tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật.
Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện
và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan. Bằng cách sử
dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading
frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để

vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora
subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y
1
và Y
2

cho phép khuếch đại một trình tự có kích thƣớc 434bp. Phân tích RFLP trên sản phẩm
PCR đƣợc tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì
thấy có sự đa hình giữa các dòng.
Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về
việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium).
2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra
Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn
tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dƣ cây trồng, trong đất, nƣớc và các vector
truyền khác. Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng đƣợc truyền thông qua hạt giống hoặc
các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh. Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây