TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN
LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
VI KHUẨN Aeromonas hydrophila
PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus)
BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần thơ, 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
i
LỜI CẢM ƠN
Được làm và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp là mong muốn của các sinh
viên. Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu
cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị.
Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy
sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và
nghiên cứu tại trường.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã
tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt
thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tình quan tâm động
viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập.
Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị
Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu
trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng
sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách bằng 2
cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng
với nước muối sinh lý). Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala
et al (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và ctv (2008).
Kết quả điện di sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu
DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện diện
của vi khuẩn A. hydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp.
Điện di sản phẩm PCR của 7 chủng A. hydrophila mà không qua bước chiết
tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được
DNA của A. hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di.
Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A.
hydrophila là 1ng/µl (hàm lượng DNA). Phương pháp PCR với hàm lượng
thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép
phát hiện A. hydrophila hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các
chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri, Pseudomonas putida,
Eschericchia coli). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
iii
iv
3.3.2 Nguồn vi khuẩn 16
3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn 17
3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 18
3.3.5 Phương pháp PCR 18
3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR 20
3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. hytrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22
4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn 23
4.3 Phát hiện vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp PCR 24
4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 26
4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 27
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
5.1 Kết luận 30
5.2 Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC 1 34
PHỤ LỤC 2 35
PHỤ LỤC 3 37
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 10
Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất
huyết và mắt lồi đục). 22
Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường Aeromonas
agar + Ampicillin. 23
Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường NA…………… 23
Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila 24
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A. hydrophila 25
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của
chủng A. hydrophila. 26
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila xác định độ
nhạy của phương pháp. 27
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương
pháp phát hiện A. hydrophila. 28
ao), đã làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quản lý tốt
môi trường nước ao nuôi. Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và
Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường
Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006). Cá tra là một
loài cá kinh tế và khi có dịch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên
cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng
ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan,
2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh
Hương, 2006), nghiên cứu khả năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri và
Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang
(Phan Khắc Huy, 2008),…
Bệnh xảy ra trên cá tra do nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm,
dinh dưỡng,…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh
nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra. Các loại bệnh do
tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột,
trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh
đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phổ biến và xuất
hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007).
Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A. hydrophila nói
riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
2
pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát
hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Cũng như Ngô Minh Dung (2007)
gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra, sau đó tái
định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1
tuần để đọc kết quả, hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục
Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng
kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả. Cụ thể
Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả
tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm
32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,9%; còn lại là các loại thủy sản khác. Theo Thứ
trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm:
Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết
với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới
nhằm đẩy giá nguyên liệu tăng lên. Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng
cho các doanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh
bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008).
Tình hình nuôi thủy sản ở ĐBSCL
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi
thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn
70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa diện tích nuôi
toàn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn). Diện
tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây.
Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tấn; năm 2002
là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng
773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn. Quy
hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước
mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày
càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL
(Phạm Đình Đôn, 2006). Song song với việc tăng diện tích và năng suất NTTS
thì vấn đề dịch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa dạng do
nhiều tác nhân.
2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản
Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước
càng bị ô nhiễm do chất thải từ các ao nuôi. Cùng với sự ô nhiễm do chất thải
từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn. Đối
với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào
chăn nuôi (thông thường 1,5-2 kg thức ăn/1 kg sản phẩm), ngoài ra còn lượng
thức ăn dư thừa lắng xuống tạo ra nguồn chất thải rất dễ phân hủy hữu cơ gây
bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá.
Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ
ràng, quá trình trao đổi chất, hình thái cấu tạo, các tổ chức cơ quan bên trong
biến đổi.
Thời kỳ khỏi bệnh: Thời kỳ này nếu cơ thể chống chịu tốt với mầm bệnh thì
cơ thể sẽ khỏi bệnh.
Thời kỳ phục hồi: Cơ thể hoạt động bình thường, chức năng sinh lý hoàn toàn
hồi phục.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
5
2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra
Theo nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam (2007).
Cá tra cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ
biến. Các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do
virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi
trường, dinh dưỡng hoặc do các vi sinh vật gây ra.
Bệnh do giáp xác ký sinh
Bệnh trùng mỏ neo
Trùng gây bệnh có tên Lernaea, có dạng giống mỏ neo, cơ thể có chiều dài 8-
16mm, giống như cái que, đầu có mấu cứng giống mỏ neo cắm sâu vào cơ thể
cá. Trùng thường ký sinh ở da, mang, vây và mắt cá.
Bệnh rận cá (Argulosis)
Trùng gây bệnh thuộc giống Argulus, có hình dạng giống con rệp nên còn gọi
là rận cá hay bọ cá, bọ ve, nhìn thấy được bằng mắt thường.
Bệnh nấm thủy mi ( Saprolegiosis)
Do 2 giống nấm Saprolegnia và Achlya gây ra gồm có Saprolegnia
parasitica, S. ferox, Achlya spp. Cá bị bệnh có dấu hiệu trên da cá xuất hiện
những vùng trắng xám, giống đám bông mềm. Nhiệt độ nước 18-25
o
Bệnh do vi khuẩn E. tarda gây ra. Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da
(phía mặt lưng). Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng
bên trong cơ và da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do
vây đuôi bị rách, gẫy. Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ,
khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng
cơ xung quanh. Ngoài ra, Trần Thị Ngọc Hân (2006) thí nghiệm gây cảm
nhiễm trên cá tra bằng 2 phương pháp ngâm và tiêm E.ictaluri kết quả đến
ngày thứ 10 bên ngoài cá có hiện tượng xuất huyết vây đuôi, trên thận có đốm
trắng.
Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản
mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm, tác nhân vi khuẩn
được coi là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy
sản (Inglish et al., 1993). Mặc khác theo Buler (2004) vi khuẩn không chỉ tồn
tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo
chất lượng nước (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008). Vi khuẩn A.
hydrophila là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và thường
gặp trên cá tra hiện nay. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
7
2.5 Sơ lược về vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá tra
Tác nhân gây bệnh
Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ
Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria. Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không
di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi
khuẩn di động bao gồm (A. hydrophila, A. caviae, A. sobria), đặc tính chung
của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ có 1 tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình
que ngắn, hai đầu tròn, phản ứng oxidase dương tính, khử nitrat, không mẫn
8
dịch nhờn có mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu
(Bùi Quang Tề, 2006).
Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện
từng mảng đỏ trên cơ thể, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên
lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng, mắt lồi mờ đục, xoang
bụng chứa dịch nội tạng hoại tử.
Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều
loài cá khác. Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A. hydrophila và
Pseudomonas fluorescens. Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ trên mặt nước, trên
thân xuất hiện điểm xuất huyết nhỏ li ti, nếu bệnh nặng thì các gốc vây cũng
xuất huyết. Bụng cá trương to, thành ruột xuất huyết, cá ít ăn hoặc bỏ ăn. Các
tia vây lưng, hậu môn và vây đuôi bị rách xơ xác (Bộ thủy sản, 2008).
A. hydrophila, A. caviae và A. sobria cả 3 loài phân lập được trên cá khi có
dấu hiệu bệnh nhiễm khuẩn huyết, mặt dù A. hydrophila là loài thường gặp
nhất. Thỉnh thoảng cũng phân lập được vi khuẩn gram âm khác như
Pseudomonas fluorescens (theo Roberts & Horne 1978, Schaperclaus 1926)
hoặc Proteus rettgeri trên cá bị nhiễm khuẩn huyết (theo Bejerano et al.
1976), có thể phân lập được đĩa cấy thuần của một chủng, hoặc kết hợp nhiều
chủng thì gây ảnh hưởng cao hơn (trích dẫn bởi Inglis et al, 1993).
Phân bố và lan truyền bệnh
Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) bệnh nhiễm trùng do A. hydrophila thường gặp ở
nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung
Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,…Ở Việt Nam, các loài cá nuôi
lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, tra, basa, trôi,
chép, mè, trê,… Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70%. Bệnh có
thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt và cá bố mẹ. Ở Việt
Nam bệnh do A. hydrophila có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập
trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuất hiện nhiều
vào đầu mùa mưa, mùa có nhiệt độ 25-28
Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A.
hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật
độ vi khuẩn 3x10
4
-3x10
8
CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x10
4
-8,5x10
8
CFU/ml),
tiêm ở cơ (8x10
4
-8x10
8
CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x10
4
-4,6x10
8
CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới
da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD
50
là 10
6,4
CFU/ml (trích dẫn
bởi Ngô Minh Dung, 2007).
Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng
A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 10
3
một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi
(oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA, các nucleotide tự do và dung dịch
đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra
nhanh chống, thậm chí với một tiểu phần virus. Hiện nay PCR được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh.
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ( 2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều
chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn là:
Giai đoạn 1 (biến tính – denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) cuả phân tử, thường là 94-
95
o
C trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch
đơn.
Giai đoạn 2 (lai –hybridization): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn
Tm của các mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ
này dao động trong khoảng 40-70
o
C. Tùy thuộc vào Tm của các đoạn mồi sử
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
11
dụng mà thời gian bắc cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là
giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
Giai đoạn 3 (tổng hợp –extension): Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, đó là điều
kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo
nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase
hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
12
Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản
ứng PCR. Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược
không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5
o
C và nhiệt độ
nóng chảy của mồi khoảng 72
o
C. Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30
nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi
dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị
Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005). Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể
bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn
PCR không thành công. Tỷ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-
75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững. Tuy nhiên trình tự G-C
không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi. Các mồi chọn phải đặc trưng cho
trình tự DNA cần khuếch đại. Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự nằm
giữa hai mồi không quá lớn 1 kb. Sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi
đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do. Do đó đầu 5’ của mồi có
thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter). Thể
tích mồi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM. Thể tích mồi thường được xác định dựa
vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006).
Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP) khoảng 20-200 µM/ mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp
sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự
khuếch đại “ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Nồng độ Mg
2+
: Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) ion Mg
là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký
sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay
được chẩn đoán bằng PCR bao gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng
(YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV),
virus gây hội chứng Taura (TSV).
2.6.4 Đối chứng
Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau.
- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để
kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm.
- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được
khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ.
2.6.5 Hạn chế của PCR
- Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn DNA có
chiều dài lớn hơn 3kb ( kết quả tốt với những đoạn DNA có chiều dài
nhỏ hơn 1,5 kb).
- Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước, dễ bị
tạp nhiễm do tính nhạy cảm và lỗi thao tác.
- Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì
enzyme gắn sai một nucleotic).
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do
vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết gây
ra. Bên cạnh đó việc phát hiện mầm bệnh riêng lẽ bằng PCR thường gây
tốn kém, do đó các nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chi phí bằng cách
sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR để phát hiện
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
14
cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Trần Linh Phước, 2003;
trích dẫn bởi Phạm Thị Thu Trang, 2005).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
15
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
16
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy phục hồi vi khuẩn: Nutrient Agar (NA), Aeromonas
agar + Ampicillin (18,35g agar + 1 lọ trong 500ml nước), Nutrient Broth
(NB).
- Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy điện di
TAE.
- NB (8g Nutrient Broth, trong 1 lít nước cất).
- TE (pH 8.0) gồm 10 mM Tris HCl và 1mM EDTA.
- Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Buffer 10X, MgCl
2
, dNTPs (10
mM), Taq DNA polymerase (5U), mồi, nước cất 2 lần.
- Cồn tuyệt đối, nước cất, NaCl.
Bảng 3.1 Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al.,
2007).
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển
- Dự kiến thu khoảng 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe (mẫu
được thu từ tháng 12/2008 đến tháng 2/2009).
- Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống.
- Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí
và được phân tích ngay. Chỉ sử dụng những mẫu còn sống.
2 cá khỏe.
- Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của cá: màu sắc, vết thương, điểm xuất
huyết.
- Mổ cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng: điểm xuất huyết, mùi,
màu sắc các cơ quan nội tạng.
- Cấy vi sinh từ các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) lên môi trường NA
(Nutrient agar) và môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin.
Các thao tác được thực hiện bên ngọn đèn cồn và các dụng cụ được vô
trùng, để trách tạp nhiễm.
- Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30
o
C. Sau 18-24 giờ quan sát và ghi
nhận hình dạng của khuẩn lạc, nếu đĩa cấy chưa thuần tiếp tục tách ròng
sang đĩa NA để đạt đĩa cấy thuần.
Sau đó nhuộm gram, xem tính di động, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản. Nếu vi
khuẩn di động, gram âm, Oxidase dương tính, Catalase dương tính thì đem
nuôi trong môi trường lỏng NB (5ml) sau 18-24 giờ ở 28-30
o
C.
Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống, các chỉ tiêu sinh hoá
được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993). Sau đó định
danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E.
Kết quả định danh được 8 chủng A. hydrophila, sau đó trữ vi khuẩn trong ống
eppendorf có chứa 50% glycerol (nước cất:glycerol tỷ lệ 1:1) giữ ở (-20
o
C).
STT Địa điểm Cơ quan phân lập Ký hiệu
1
Sa Đéc
Th
ố
t N
ố
t
–
C
ầ
n Thơ
Th
ậ
n
TN(t)
7 Thốt Nốt – Cần Thơ Gan TN(g)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Copyright: Tài liệu đại học ©