TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN
Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG

2009

tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp
PCR phát hiện E. ictaluri.
Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui
trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl
(40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl
(2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút.
Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ
thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2
ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E.
ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA
polymerase từ 5U/µl xuống còn 3U/µl.
Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui
trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị
trí 407bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- iii -
MỤC LỤC

Trang

3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể 15
3.3.1.2 Cá thí nghiệm 15
3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm 15
3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm 16
3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 17
3.3.3 Phương pháp PCR 19
3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR 19
3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al,
1992) 19
3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy 20
3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) 20
3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) 21
3.3.3.2.3 Điện di 22
3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 22
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Kết quả phân tích vi sinh 24
4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý 24
4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 24
4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25
4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) 25
4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26
4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase
27
4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ
bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút.
27
4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 28
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

polymerase 5U/µl) 31
Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA
polymerase 4U/µl) 31
Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA
polymerase 3U/µl) 32

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- vii -
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 24
Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ
thận 29
Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ
vi khuẩn 29
Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. 30
Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA
polymerase khác nhau 32
Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid
nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) 33
Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1 34
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu 35

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 1 -

quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị. Khi cá
nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào
cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004).
Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm
ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời. Hiện nay
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 2 -
phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ
biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E. Tuy
nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa
đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay. Gần đây
Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán
nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp
định danh truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một
bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn
thuần. Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời
gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày). Do đó đề
tài “Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực
tiếp từ mô cá bệnh” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát
hiện E. ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này.
Mục tiêu
Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri từ mô cá
bệnh
Nội dung
1. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh
2. Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri
3. Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E.
ictaluri
điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản
càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành
nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân
tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Bùi Quang Tề, 2004).
Ngoài ra, theo Lê Xuân Sinh và Lê Lệ Hiền (2008), trong tổng chi phí nuôi cá
tra, thức ăn chiếm khoảng ¾, điều này có tác động lớn tới môi trường nước -
một trong những nguyên nhân quan trọng nhất đối với việc bệnh xuất hiện
ngày càng nhiều trên cá tra nuôi.
Có nhiều loại tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi, tuy nhiên vi khuẩn là một tác
nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển và gây hạn
chế mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung, 2008)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 4 -
Theo Trần Anh Dũng (2005), khi nghiên cứu khảo sát tác nhân gây bệnh trên
cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy, bệnh trên cá tra nuôi sự xuất hiện
có tính mùa vụ rõ rệt, bệnh do ký sinh trùng hầu như xuất hiện quanh năm
nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa và mùa lũ rút, mùa khô thường ít hơn mùa
lũ. Bệnh do vi khuẩn xuất hiện quanh năm, bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào
mùa lũ, bệnh xuất huyết xuất hiện nhiều vào mùa lũ rút. Theo đó, tỉ lệ nhiễm
các bệnh do vi khuẩn như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ chiếm 68,3%, mủ gan chiếm
61,0%, phù đầu 51,2% và bệnh vàng da chiếm 24,4%.
Kết quả điều tra tại An Giang và Cần Thơ cho thấy các loại bệnh phổ biến
trong nuôi cá tra thâm canh ở hai địa phương này là bệnh gan thận mủ, bệnh
đốm đỏ, bệnh phù đầu, bệnh lở loét, trắng mang – trắng đuôi, lồi mắt-nổ mắt,
nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó bệnh thường gặp
và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận mủ với tỷ lệ chết là 80 – 90% nếu không
có biện pháp điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Tấn Duy Phong,
2008).
2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam

Thảo, 2008).
Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xuất hiện từ cuối 1998 và trở nên trầm
trọng vào 1999. Ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ. Tuy
nhiên bệnh bộc phát cao điểm vào tháng 7 và 8. Bệnh đốm trắng trên gan xuất
hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá giống và cá thịt, ở cả cá nuôi ao và
nuôi bè.
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri
Vi khuẩn E. ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm,
hình que, kích thước thay đổi, di động yếu ở 25-30°C, ở nhiệt độ cao hơn
không di động, H
2
S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F. Cho phản
ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase. E. ictaluri phát
triển tốt ở 28
o
C trên môi trường TSA trong 48h tạo thành những khuẩn lạc
màu trắng đục kích thước rất nhỏ, không có nhân, rìa có dạng không đồng
nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Tuy nhiên Plumb (1993) cũng có một số mô tả khác như có dạng hình que và
kích thước biến đổi. So với E. tarda phát triển tốt ở 37
o
C trong khi E. ictaluri
phát triển tốt ở 28
o
C, điều này lý giải vì sao vi khuẩn E. tarda ngoài gây bệnh
trên cá còn gây bệnh trên nhiều loài động vật máu nóng khác như chim, gia
súc, heo, động vật có vú ở biển. E. ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá.
Dấu hiệu bệnh lý
Theo Lê Thị Bé Năm (2002), cá bị bệnh thường giảm hoặc bỏ ăn, cá nổi trên
mặt nước, bơi lội chậm chạp, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với

CFU/ml.
Với thí nghiệm gây cảm nhiễm của Huỳnh Chí Thanh (2007), kết quả cho thấy
cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở mật độ vi khuẩn 1,02x10
8
CFU/ml với tỷ lệ
91,66%. Với các mật độ 1,02x10
7
CFU/ml, 1,02x10
6
CFU/ml, 1,02x10
5

CFU/ml có tỷ lệ chết tương ứng là 66,66%, 33,33 % và 25%. Qua đó xác định
được LD
50
là 3,16x10
6
CFU/ml.
Theo nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II kết hợp với
công ty thuốc Thú Y TW (Navetco) (2008) sau khi phân lập và định danh vi
khuẩn cho thấy 97% mẫu cá bệnh đều có dấu hiệu điển hình của bệnh đốm
trắng với sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri. Tiến hành thí nghiệm cảm
nhiễm ngược, vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là vi khuẩn E. ictaluri được
phân lập từ các mẫu cá bệnh. Kết quả nghiên cứu đã xác định, vi khuẩn E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận và lách cá tra. Kết quả
thí nghiệm cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD
50
) là 2,5
x 10
4

môi trường có nồng độ muối cao và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích
ethanol/1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu
như toàn bộ acid nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là
không cần sự hiện diện của muối , thể tích isopropanol/thể tích mẫu là
1/1. Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó có thể
loại chúng ra khi dùng cách tủa trong isopropanol.
Trong cả hai phương pháp, acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng cách ly tâm.
Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các
dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu.
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh từ năm 1985 và được thừa
nhận chính thức từ năm 1993 qua giải thưởng Nobel cho Kary Mullis - người
phát minh ra nó, PCR hiện đang được ứng dụng rộng khắp tại Việt Nam.
Nguyên tắc (Đặng Thị Hoàng Oanh 2007)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 8 -
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn,
và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn
DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và
một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm ba giai đoạn sau:
Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn
nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95
o

- 9 -
Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005), phản ứng PCR có các nhân tố
ảnh hưởng sau:
- ADN mẫu: Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu ADN không được dài
quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn ADN dài khoảng 1 –
1.5kb. Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt , tuy nhiên kỹ thuật chẩn
đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu
ADN không cần có độ tinh sạch cao.
- Enzyme ADN-polymerase: Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào
khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase do phản ứng luôn phải
thực hiện ở nhiệt độ khác nhau. Enzyme thường được dùng là Taq-
polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối
nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao. Nhược điểm của enzyme này là
không tổng hợp được trình tự ADN dài quá 3kb, hơn nữa enzyme này
không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép.
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng để
đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Chọn mồi phải
tuân theo nguyên tắc sau đây:
• Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và
mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc.
• Mồi phải chọn đặc trưng cho ADN cần khuếch đại và không trùng
với các trình tự lặp lại trên gen
• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)
• Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ
hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30
nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp.
• Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thường
trong khoảng từ 4-5
0
C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng

độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình
phản ứng. Tuy nhiên, với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng
cụ khuếch đại riêng.
Ứng dụng của phương pháp PCR
Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc
phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh
thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm:
virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan
tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV)
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Theo Lê Đình Lương (2004) kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong
khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội.
- Trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật PCR giúp phát hiện đột biến, cho
phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu
quá trình tiến hóa ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen
đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.
- Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, kỹ thuật PCR cho phép lựa
chọn cặp cha mẹ làm giống chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ.
- Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh truyền nhiễm do
virus, vi khuẩn, HIV-AIDS…
Các hạn chế của phương pháp PCR
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 11 -
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007), phương pháp PCR có các hạn chế sau:
- Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những
đoạn DNA lớn hơn 3kb
- Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước.
- Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì
enzym gắn sai 1 nucleotic)
Một số nghiên cứu về PCR

sản phẩm thu được sau khi điện di trên agarose 1% cho sản phẩm có kích
thước phân tử lớn hơn 1kb. Dùng ADN ly trích được thực hiện phản ứng PCR,
sản phẩm thu được có kích thước khoảng 300-400 bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 13 -
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 01/2009 đến tháng 06/2009.
Địa điểm thu mẫu: Thu mẫu từ cá gây cảm nhiễm ở thí nghiệm LD
50
của bộ
môn sinh học và bệnh thủy sản - khoa Thủy Sản.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản – Khoa
Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Dụng cụ và hóa chất
3.2.1 Dụng cụ
3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn
- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt
- Ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh
- Chai 100ml, 250ml, 500ml
- Lame, lamelle
- Viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn
- Tủ ấm, nồi thanh trùng
3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR
- Ống tub 1.5ml, 0.5ml, 0.2ml, khay đựng ống tub, que nghiền
- Cân điện tử
- Micropipet các loại

- Ethanol
- Lysis buffer: 0.5M NaCl; 0.001M EDTA; 1% Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS); 0.8% Triton; 0.1M Tris-HCl
- SDS 10%
- Proteinase K
- RNase-A
- Chloroform-Isoamyl (24:1)
- Phenol-Chloroform-Isoamyl (25:24:1)
- Isopropanol
- Cồn 70%
- TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, pH=7)
- Buffer 10X, MgCl
2
, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- 15 -
- Agarose
- TAE 0,5X
- Loading dye
- Ethidium bromide
- Nước tiệt trùng 2 lần
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm
3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể
- Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200ppm,
phơi khô.
- Cấp nước vào bể, có sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine.
- Đối với bể lớn 2m
3
để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, có sục khí

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt
trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt
trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000
vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và
dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml
dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex.
Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước
sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ướng để xác định mật độ vi khuẩn.
OD=0.1±0.02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 10
8
cfu/ml.
3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm
thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần với mật độ 10 con/bể.
Ø Nghiệm thức không tiêm.
Ø Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý.
Ø Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
2
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
3
CFU/ml).
Ø Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 10
4
CFU/ml).