Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ

270
ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT
PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila
NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus)
Đặng Thị Hoàng Oanh
1
và Đỗ Xuân Hoa
1ABSTRACT
A Syber green realtime-PCR protocol to detect Aeromonas hydrophila bacteria
which causes haemorhagic disease in striped catfish (Pangasianodon
hypophthalmus) was set up and optimized. Forward and reverse primers from
Panagala et al. (2007) were used to amplified a 209 bp unique sequence of
aerolysin gene of A. hydrophila. The optimized protocol can detect DNA from
A. hydrophila as low as 100 pg. The specificity of the protocol were tested with
other common bacteria in aquaculture including Vibrio harveyi, V.
anguillarum, V. alginolyticus, Aeromonas carviae, Edwardsiella ictaluri,
Pseudomonas putida, Escherichia coli and Bacillus subtilis. The result showed
that optimized realtime PCR protocol can be applied for specific, rapid and
sensitive detection of A. hydrophila infection in striped catfish in seed selection
and effective prevention and treatment of bacterial disease in catfish.
Keywords: Striped catfish, Aeromonas hydrophila, realtime PCR.
Title: Study on the application of realtime PCR protocol to detect Aeromonas
hydrophila bacterial infection on the striped catfish (Pangasianodon
hypophthalmus)
TÓM TẮT

Có nhiều phương pháp để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila nhiễm trên cá tra.
Các phương pháp được sử d
ụng phổ biến hiện nay là phương pháp xác định
đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kít API 20E. Phương
pháp PCR cũng được ứng dụng để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila trực tiếp từ
mô thận cá tra (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Tuy nhiên
thời gian phát hiện mầm bệnh của các phương pháp vẫn này còn dài và định
tính. Việc ứng dụng một phương pháp xác định nhanh, chính xác hơn và định
lượng mầm bệnh vi khu
ẩn A. hydrophila ở cá tra là nhu cầu cấp thiết trong việc
quản lý dịch bệnh xuất huyết ở cá tra. Trong nghiên cứu này kỹ thuật PCR thời
gian thật (realtime-PCR/qPCR) chẩn đoán bệnh xuất huyết do vi khuẩn A.
hydrophila gây ra trên cá tra được thực hiện, chuẩn hóa và ứng dụng nhằm rút
ngắn thời gian phát hiện cũng như xác định mức độ nhiễm vi khuẩn A.
hydrophila trên cá tra, góp phần vào việc chọn giống, phòng ngừa và quản lý
bệnh này.
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn được chọn để nghiên cứu là A. hydrophila CA.1.2T thuộc bộ
sưu tập vi khuẩn, Khoa Thủy sản. Chủng vi khuẩn này được phân lập từ cá tra
có dấu hiệu bệnh xuất huyết, vi khuẩn được nuôi trong môi trường nutrient
broth (NB) có bổ sung 25% glycerol và giữ ở -80°C. Vi khuẩn được phục hồi
trên môi trường Trypton soya agar (TSA) và ủ ở 28
°C trong vòng 24 giờ. Sau
đó chọn một khuẩn lạc rời từ đĩa cấy thuần cấy lên môi trường aeromonas agar,
ủ ở 28°C trong vòng 24 giờ, sau đó nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường
NB. Vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp PCR (Nguyễn Hà Giang và
Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010) để được xác định là A. hydrophila trước khi sử
dụng để thực hiện và chuẩn hóa qui trình qPCR.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ

dụng để vẽ đường chuẩn dựa trên kết quả chu kỳ ngưỡng (Ct) (chọn 3 kết quả
có giá trị gầ
n nhau nhất để vẽ đường chuẩn). Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu
của qui trình PCR được thực hiện với các loài vi khuẩn phổ biến trong thủy sản
là Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri, A.
carviae, Pseudomonas putida, Eschericchia coli và Bacillus subtilis.
Sản phẩm qPCR được điện di trên gel 2% agarose trong dung dịch TAE 0,5X
để xác định mức độ khuếch đại và trọng lượng phân tử đoạn DNA của vi khuẩn
A. hydrophila cần phát hiện là 209 bp dựa vào thang DNA 1 kb plus
(Invitrogen).
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thiết lập đường chuẩn phát hiện vi khuẩn A. hydrophila
Vi khuẩn A. hydrophila sau khi được phục hồi trên môi trường TSA, tiếp tục
được nuôi tăng sinh trong môi trường NB, sau đó chiết tách DNA và pha loãng
về các hàm lượng 0,1, 1, 10 và 100 ng/μl để thực hiện phản ứng qPCR. Kết quả
cho thấy qui trình qPCR cho kết quả khuếch đại dương tính với vi khuẩn A.
hydrophila ở tất cả các hàm lượng DNA thử nghiệm (Hình 1). Trong khi đó đối
với mẫu đối chứng âm (nước) thì không có sản phẩm PCR. Chu kỳ phát hiện
của mẫu có hàm lượng 100 ng khoảng 24, mẫu có hàm lượng 10 ng có chu kỳ
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ

273
phát hiện khoảng 27, mẫu có hàm lượng 1 ng có chu kỳ phát hiện khoảng 30,
mẫu có hàm lượng 0,1 ng có chu kỳ phát hiện khoảng 34.

Hình 1: Sơ đồ khuếch đại của sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila từ DNA vi
khuẩn
1: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 100ng; 2: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 10ng; 3: mẫu DNA vi
khuẩn có hàm lượng 1ng; 4: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 0,1 ng.
Như vậy, số bản sao đích ban đầu càng cao thì chu kỳ phát hiện càng sớm và

33,38

Đối chứng âm (nước)
Không xác định Không xác định
Không xác định
Không xác định
Dựa vào giá trị Ct trung bình (Bảng 1) cho thấy mẫu có hàm lượng DNA gấp
10 lần độ pha loãng hàm lượng DNA mẫu kế tiếp có chu kỳ phát hiện sớm hơn
khoảng 3,3 chu kỳ. Kết quả trên phù hợp với kết quả của Hunt (2007). Tính
trung bình 3 giá trị Ct gần nhất ở 4 lần lặp lại của cùng 1 mẫu và thiết lập
phương trình đường chuẩn biểu hiện mối tương quan giữa giá trị Ct và hàm
lượng DNA vi khuẩn A. hydrophila thì được biểu đồ đường chuẩn ở hình 2.
Hệ số tương quan bình phương thu được là R
2
=0, 9919 chứng tỏ mối tương
quan giữa Log
10
(hàm lượng DNA) và giá trị Ct cao và tuân theo phương trình
y= -3,238x+30,144. Từ phương trình đường chuẩn này có thể ứng dụng cho
việc định lượng bằng cách tính hàm lượng DNA vi khuẩn A. hydrophila ban
đầu dựa vào giá trị Ct trung bình.
Sản phẩm của phản ứng qPCR được điện di trên gel 2% agarose nhằm kiểm tra
kích thước sản phẩm PCR và hàm lượng DNA trên mẫu (Hình 3). Kết quả điện
di cho thấy sản phẩm qPCR là 209 bp phù hợp với vị trí của mồi được thiết kế
để phát hiện gen aerolysin của vi khuẩn A. hydrophila (Panagala et al., 2007).
Thêm vào đó, độ sáng của vạch giảm dần thể hiện hàm lượng DNA ban đầu
của mẫu phía trước gấp 10 lần độ pha loãng hàm lượng DNA ban đầu của mẫu
kế tiếp.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ


2
= 0.9919
20
22
24
26
28
30
32
34
36
-1 0 1 2
Log
10
(hàm lượng DNA vi khuẩn)
giá trị Ct
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ

276
3.2 Tính đặc hiệu của qui trình qPCR phát hiện A. hydrophila
Qui trình qPCR phát hiện vi khuẩn A. hydrophila được kiểm tra tính đặc hiệu
bằng cách sử dụng qui trình để phát hiện các loại vi khuẩn thường gặp trong
thủy sản nước ngọt và nước lợ là Aeromonas sp, A. carviae, Bacillus subtilis,
Eschericchia coli, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas putida, Vibrio harveyi,
V. aginolyticus, V. anguillarum. Sơ đồ huỳnh quang (Hình 4) cho thấy chỉ
đường huỳnh quang của A. hydrophila tăng lên đáng kể
chứng tỏ gen mục tiêu
của vi khuẩn A. hydrophila được sự khuếch đại, các mẫu còn lại đều cho kết
quả không xác định ở 4 lần lặp lại, đồng nghĩa với không có sự khuếch đại
DNA xảy ra ở các mẫu này. Từ kết quả này đã nói lên được tính đặc hiệu của

of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Mekong Delta
(Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 61(3).
Nguyễn Hà Giang, Trương Quỳnh Như, Lê Hữu Thôi và Đặng Thị Hoàng Oanh
(2010). Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Aeromonas
hydrophila trên thận cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) bệnh xuất huyết.
Tạp chí Khoa học, Đại họ
c Cần Thơ. 16a: 136- 142.
Pananagala V. S., C. A. Shoemaker, V. L. van Santen, K. Dybvig, P. H. Klesius.
(2007). Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish
pathogen, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas
hydrophila. Diseases of aquatic organisms, 74: 199-208.