Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ

233
HOÀN THIỆN QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT
HIỆN ĐỒNG THỜI VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM
TRẮNG (White Spot Syndrome Virus) VÀ VI RÚT
GÂY BỆNH CÒI (Monodon Baculovirus) Ở TÔM SÚ
(Penaeus monodon) CÓ SỬ DỤNG GEN β-ACTIN
LÀM NỘI CHUẨN
Trần Việt Tiên
1
và Đặng Thị Hoàng Oanh
1

ABSTRACT
A multiplex RT-PCR protocol for simultaneous detection of WSSV and MBV in
black tiger shrimp Penaeus monodon and to control false negative by detecting
shrimp endogenous genes. Based on PCR protocols to detect WSSV from OIE
(2006), MBV from Belcher và Young (1998) and RT-PCR protocol to detect
β
-
actin endogenous gene from Oanh (2008), mPCR protocol for simultaneous
detection of WSSV, MBV and β-actin gen were developed with PCR product of
1447 bp (WSSV), 361 bp (MBV) and 216 bp (β-actin). This mPCR protocol has
a practical application by using internal control β-actin and reduced cost and
save time as two viruses will be detected in a single PCR reaction.
Keywords: Penaeus monodon, mPCR, WSSV, MBV, internal control.
Title: Development of multiplex PCR protocol for simultaneous detection of
white spot syndrome virus and monodon baculovirus in black tiger shrimp
(Penaeus monodon) by using
β

rút gây nên. Hiện nay các tác nhân gây bệnh đã xuất hiện ở khắp nơi và có xu
hướng ngày càng tăng. Những vi rút gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm sú
là vi rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV), vi rút gây
bệnh còi (Monodon Baculovirus - MBV), vi rút gây bệnh đầu vàng (Yellow
Head Virus - YHV)…. Hiện nay hiện tượng đa nhiễm trên tôm xuất hiện ngày
càng nhiều vì thế phát hi
ện sớm, phát hiện đồng thời mầm bệnh vi rút để chọn
giống là một rong những biện pháp hữu hiệu trong quản lý bệnh tôm. Có nhiều
phương pháp được phát triển để phát hiện những loại vi rút này như mô học,
nhuộm nhanh, phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR),
lai tại chỗ (In situ hybridization). Trong đó PCR là phương pháp cho phép phát
hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Một dạng biến hoá của PCR là
multiplex PCR (mPCR), phương pháp này sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để
khuếch đại nhiều phân đoạn DNA trên một khuôn trong một phản ứng. Tuy
nhiên một trong những hạn chế đáng kể của PCR là hiện tượng âm tính giả.
Trong số các qui trình PCR phát hiện vi-rút trên tôm trong đó có qui trình phát
hiện MBV (Belcher và Young, 1998) được sử dụng không có nội chuẩn để
kiểm soát trường hợp âm tính giả. Để ngăn ngừa tổn thất do vi rút gây ra và
đồng thời từng bước khắc phục trường hợp âm tính giả chúng tôi phát triển qui
trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV và sử dụng gen β-actin làm nội
chuẩn nhằm phát hiện sớm, chính xác và đồng thời WSSV và MBV để giảm
chi phí phân tích và kiểm soát trường hợp âm tính giả do DNA ly trích có chất
lượng kém hay do lỗi thao tác khi thao tác PCR.
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mẫu vật
Mẫu tôm nhiễm WSSV được xét nghiệm và cho kết quả dương tính bởi kít IQ
2000 WSSV (thực hiện theo qui trình hướng dẫn của Công ty Farming
Intelligene Technology Corperation, Đài Loan). Mẫu tôm nhiễm MBV được
xét nghiệm và cho kết quả dương tính bởi Kit WSSV/MBV của Công ty Nam
Khoa.

(1,5 mM); dNTPs (200
μM); Taq DNA polymerase (2 UI); 34,6 μl nước; mồi 146 F
2
(1 μM), 146 R
2

(1 μM) và 5 μl sản phẩm PCR bước 1. Chu kỳ nhiệt phản ứng là 94°C trong 4
phút; 55°C trong 1 phút; 72°C trong 2 phút; sau đó 94°C trong 1 phút; 55°C
trong 1 phút; 72°C trong 2 phút; lặp lại chu kỳ trên 39 lần; 72°C trong 5 phút;
giữ 4°C. Mẫu dương tính với WSSV sẽ hiện vạch ở vị trí 1447 bp (bước 1) và
941 bp (bước 2) trên gel agarose 1,5%.
Qui trình PCR phát hiện MBV được thực hiện theo Belcher và Young (1998)
(có chỉnh sửa) như sau: dung dịch đệm (1X); MgCl
2
(1,5 mM); dNTPs (200
μM); Taq DNA polymerase (1,25 UI); 16,25 μl nước; mồi MBV 1.4 NF (0,4
μM), mồi MBV 1.4 NR (0,4 μM) và 400 ng DNA (MBV). Chu kỳ nhiệt phản
ứng là 95°C trong 5 phút; sau đó 95°C trong 30 giây; 60°C trong 1 phút; 72°C
trong 2 phút; lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72°C trong 5 phút; giữ 4°C. Mẫu hiện
vạch ở vị trí 361 bp là mẫu dương tính với MBV.
Qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008) gồm:
dung dịch đệm (1 X); MgCl
2
(2,5 mM); dNTPs (200 μM); Taq DNA
polymerase (1,25 UI); 15,75 μl nước; mồi β-actin F (0,5 μM), mồi β-actin R
(0,5 μM) và 100 ng sản phẩm sao mã ngược/DNA. Chu kỳ nhiệt phản ứng là
94°C trong 1 phút; sau đó 94°C trong 25 giây; 58°C trong 30 giây; 72°C trong
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ

236

237
trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin. Mồi β-actin F (0,25
μM); mồi β-actin R (0,25 μM) và 200 ng DNA (MBV) được sử dụng đồng thời
cùng với qui trình. Chu kỳ nhiệt phản ứng là 95°C trong 5 phút; sau đó 95°C
trong 30 giây; 60°C trong 1 phút; 72°C trong 2 phút; lặp lại chu kỳ trên 35 lần;
72°C trong 5 phút; giữ 4°C. Kết quả điện di sản phẩm mPCR (hình 2, giếng 3)
mẫu hiện đồng thời hai vạch: vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV; vạch
216 bp là gen β-actin của tôm. Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β-actin trên tôm. M:
thang đo (1Kb plus, Invitrogen); 1: đối chứng âm; 2: mẫu phát hiện
MBV; 3: mẫu phát hiện MBV và β-actin; 4: mẫu phát hiện β-actin; 5:
mẫu âm tính.
3.3 Qui trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và gen β-actin ở tôm
Kết quả đạt được từ hai qui trình kép phát hiện WSSV-β-actin; MBV-β-actin,
qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV và gen β-actin được thực
hiện gồm: dung dịch đệm (1 X); MgCl
2
(3 mM); dNTPs (200 μM); Taq DNA
polymerase (2,5 UI); 27,5 μl nước; mồi 146 F
1
(0,5 μM), mồi 146 R
1
(0,5 μM);
mồi MBV 1,4 NF (0,4 μM), mồi MBV 1,4 NR (0,4 μM), mồi β-actin F (0,15
μM); mồi β-actin R (0,15 μM) và 200 ng DNA (WSSV) 600 ng DNA (MBV).
Chu kỳ nhiệt phản ứng là 95°C trong 5 phút; sau đó 95°C trong 30 giây; 60°C
trong 1 phút; 72°C trong 2 phút; lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72°C trong 5 phút;
giữ 4°C. Kết quả chạy điện di (Hình 3) cho thấy ở giếng 3 nếu mẫu nhiễm cả

vậy vấn đề đặt ra ở đây là làm thế nào để có thể nhận biết được khi nào kết quả
là âm tính thật? Như đã biết, β-actin là một gen nội sinh, tồn tại khắp nơi trong
cơ
thể sinh vật và có tính bảo tồn cao, có vai trò quan trọng trong việc thể hiện
những chức năng cơ bản trong cơ thể sinh vật (Zhu et al., 2005). Gen nội sinh
β-actin của tôm sú đã được sử dụng làm nội chuẩn trong qui trình mPCR phát
hiện GAV (Trần Việt Tiên và ctv., 2008), qui trình mPCR phát hiện đồng thời
WSSV và HPV (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2010) và qui trình mPCR phát
hiện IHHNV (Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Dựa trên kết
quả của các qui trình đã được công bố, β-actin tiếp tục được chọn để thiết kế
làm nội chuẩn cho qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV và MBV. Kết
quả qui trình phát hiện WSSV, MBV và β-actin cho thấy qui trình có khả năng
ứng dụng tốt cho việc phát hiện chính xác tác nhân gây bệnh trên tôm sú và có
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ

239
thể kiểm soát được trường hợp âm tính giả trong xét nghiệm thông qua nội
chuẩn.
4 KẾT LUẬN
Trên cơ sở đạt được trước đó của 2 qui trình: (1) Qui trình mPCR phát hiện
đồng thời WSSV và nội chuẩn, sản phẩm PCR cho kết quả đồng thời hai vạch
WSSV ở vị trí 1447 bp và 216 bp (β-actin) và (2) Qui trình mPCR phát hiện
đồng thời MBV và nội chuẩn, sản phẩm PCR cho kết quả đồng thời hai vạch
MBV (361 bp) và 216 bp (β-actin). Qui trình mPCR được thực hiện và chuẩn
hóa phát hiện đồng thời WSSV, MBV và nội chuẩn, thành phần hóa chất bao
gồm: dung dịch đệm (1 X); MgCl
2
(3 mM); dNTPs (200 μM); Taq DNA
polymerase (2,5 UI); 27,5 μl nước; mồi 146 F
1

infection in Penaeus monodon shrimp postlarvae in an Indian hatcherry. Dis
Aquat Org. 48: 233-236
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ

240
Natividad, K. D. T., M. V. P. Migo, J. D. Albaladejo, J. P. V. Magbanua, N.
Nomura, M. Matsumura. 2006. Simultaneous PCR detection of two shrimp
viruses (WSSV and MBV) on postlarvae of Penaeus monodon in the
Philippines. Science Direct. Aquaculture 257: 142-149.
Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008. Phát triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase
Chain Reaction) phát hiện WSSV (White Spot Syndrome Virus), HPV
(Hepatopancreatic Parvovirus) và gen nội chuẩn β-actin ở tôm sú (Penaeus
monodon). Luận văn Đại học. Đại học Cần Thơ.
Trần Viết Toàn, 2009. Phát triển qui trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β-
actin trên tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn Đại học. Đại học Cần Thơ.
Trần Việt Tiên, Trần Thị Mỹ Duyên và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008. Phát triển
qui trình mRT-PCR phát hiện GAV (Gill-associated virus) và Beta-actin ở
tôm sú. Tạp chí khoa h
ọc, Đại học Cần Thơ, Q1: 176-180.
Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010. Phát triển qui trình mRT-PCR
phát hiện đồng thời White Spot Syndrome Virus, Infectious Hypodermal and
Hematopoietic Necrosis Virus ở tôm sú (Penaeus monodon) và sử dụng gen
Beta-actin làm nội chuẩn. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 15B: 91-96.
Vandekerckhove, J., K. Weber, 1984. Chordate muscle actins differdistinctly from
invertebrate muscle actins. The evolution of the different vertebrate muscle
actins. J. Mol. Biol. 179: 391–413.
Zhu, X.J., Z.D. Dai, J. Liu, W.J. Yang, 2005. Actin gene in prawn,
Macrobrachium rosenbergii: characteristics and differential tissue expression
during embryonic development Comparative Biochemistry and Physiology
Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 140 (4): 599-605.