TCNCYH 38 (5) - 2005
XÂY DNG PHNG PHÁP CHN OÁN NHANH VI KHUN
DCH HCH (YERSINIA PESTIS) T MU T VÀ
NC NHIM KHUN

Lê Thanh Hoà
1
, Nguyn Th Bích Nga
1
,
Nguyn Th Ngc Dao
1
,  Ngc Khuê
2
1
Vin Công ngh Sinh hc
(Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam)
2
Phân Vin Công ngh mi và Bo v Môi trng
(Trung tâm KHKT - CNQS), B Quc Phòng
)

.

:

Duyên Hi min Trung Vit Nam, cho đn nay, vn
có nhiu trng hp b dch hch, do vy, loi vi
khun nguy him này vn là mi đe do sc kho
cng đng [3,4]. Dch hch do b chét và loài gm
nhm làm môi gii truyn lây gây bnh, và t
n ti
lu cu trong đt và nc, to nên ngun lây sang
ngi. Có 3 loi plasmid mà vi khun này s hu
bao gm, plasmid CD1 (chung vi Y.
pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmid
MT1 và pPCP1 (là 2 loi riêng ca Y. Pestis) [1].
Chn đoán nhanh vi khun dch hch không có gì
khác là da vào phn ng PCR, s dng các gen
đc lc ca các loi plasmid này làm ch th di
truyn phân t, trong đó gen pla ca pPCP1 đc
coi là tin tng nht [2,7]. Y. pestis phân lp 
Vit Nam đã đc chính th
c giám đnh, s dng
gen pla, gii trình và phân tích trình t ca gen
này và đng ký Ngân hàng Gen s AY305870 [2].
Plasmid đc lc pPCP1 ca vi khun dch hch Vit
Nam có mc đ bo tn tuyt đi v thành phn
nucleotit ca h gen, ít nht là qua so sánh 480
nucleotit ca phân đon gen pla, vi các chng
KIM5; CO92 [8,9] và mt s chng ca n , th
hin tính gây bnh thng nht toàn cu ca loài vi
khun này [2]. M
c tiêu:
1. Xác đnh đ nhy và chính xác ca
phn ng PCR chn đoán vi khun d ch hch.

Dung gii, tinh sch và ly chit ADN bng các dung
dch ca b kit theo hng dn, cui cùng thu ADN
tng s và bo qun  –20
0
C, cho đn khi s
dng. ADN ca plasmid pPCP1, đc thu nhn
bng mt phng pháp khác, là s dng b hoá
cht QiaPrep Spin Mini Kit ca Hãng Qiagen. V
nguyên tc, hàm lng ADN thu đc ch cha
ADN ca plasmid pPCP1; và nh vy s làm khuôn
chc chn cho phn ng nhân đon gen pla trong
h gen ca plasmid này. ADN thu đc bng các
phng pháp trên đc kim tra trên thch
agarose 0,8%, tính toán hàm lng cn thit cho
phn ng PCR, và bo qun
 –20
0
C cho đn khi
s dng.
Mt cách khác cung cp khuôn cho phn ng
PCR là s dng nguyên vn vi khun, do trong quá
trình phn ng t bào b bung ra gii phóng ADN
(k c ADN ca plasmid) làm khuôn thc hin
phn ng [2].  thc hin chn đoán nhanh,
chúng tôi hoà loãng vi khun trong các mu đt và
nc trc đó đã kim tra không có vi khun dch
hch bng phng pháp nuôi cy và PCR, gi
nghim nh là m
u thu đc t hin trng. Sau
đó, mu gi nghim đc s dng tách chit ADN

hn EcoRI.
0.56kb
2.3kb
2.0bp
123M
480bp
B trí thí nghim:
Kho sát đ nhy ca PCR vi đ pha loãng
cao nht có th thc hin đc: ADN tng s sau
khi tách chit và kim tra hàm lng, đc pha 
nng đ gc 100ng/µl. T nng đ này, ADN tng
s đc pha loãng theo c s 2, gp đôi liên tc,
tc là: 100ng/µl; 50ng/µl; 25ng/µl; 12,5ng/µl;
6,25ng/µl; 3,125ng/µl Vi các đ pha loãng
khác nhau nh th này, 1µl ca mi mt nng đ
đc s dng cho phn 
ng PCR vi cp mi PLAF
- PLAR, thc hin theo qui trình  mc 3.
Gi nghim pha loãng vi khun vô hot trong
mu đt - nc và thc hin phn ng PCR: Vi
khun đc pha  nng đ gc 1000 vi khun/µl
trong mu hn hp đt-nc ly t t nhiên, sau
đó đc pha loãng liên tc theo c s 2. Vi các
đ pha loãng khác nhau nh th này, 1 µl ca mi
mt nng đ
đc s dng cho phn ng PCR vi
cp mi PLAF - PLAR, thc hin theo qui trình mô
t  trên.
2
TCNCYH 38 (5) - 2005

t
 nhy ca phn ng PCR vi đ pha loãng
cao nht, đã đc thc hin thành công, vi đ
pha loãng cao nht ca các loi khuôn, sau khi
tính toán, nh sau:
- Vi khuôn là ADN tng s:
Phn ng thc
hin đc  nng đ là 0,6ng, tng đng vi 1
vi khun Y. Pestis.
- Vi khuôn là ADN ca plasmid pPCP1:
Phn
ng thc hin đc  nng đ là 0,2ng;
- Vi khuôn là vi khun nguyên vn (không cn
tách ADN tng s):
Phn ng thc hin đc 
nng đ vi lng vi khun là khong 5 - 10 vi
khun.
- Tin hành pha loãng các loi khuôn và thc
hin phn ng PCR và nhn thy, PCR đc hiu
vn thc hin thành công  đ pha long rt cao,
tng đng vi hàm lng khuôn ADN tng s là
0,1ng - 0,6ng/phn ng. S đng ký Ngân hàng Gen Tên loài có kt qu tng đng H s Giá tr
3
TCNCYH 38 (5) - 2005
gi|48629|emb|X15136.1|YPPLA Y.pestis plasmid pKYP1 pla
gene 952
0.0 gi|5763810|emb|AL109969.1|YPPCP1 Yersinia

Hình 2. Kt qu truy cp Ngân hàng Gen s dng chui nucleotit ca gen pla thu nhn t vi
khun dch hch Vit Nam đã đc xác đnh vi h s đng nht 100% vi gen pla ca plasmid
pPCP1 ca vi khun dch hch (Yersinia Pestis) th gii.
Ghi chú: Phn mm s dng là chng trình BLAST ca NCBI (Dãy s và ký t bên trái là s đng ký;
 gia là tên loài; hai dãy cui cho bit mc đ chính xác ca kt qu phân tích sinh - tin hc t ong
chng trình BLAST.

r

Kt qu phn ng PCR vi ngun khuôn là vi khun dch hch gi nghim pha loãng trong mu đt -
nc.
123456789M
Hình 3. Kt qu phn ng PCR thu
nhn sn phm đon gen pla t khuôn
là ADN tng s đã pha loãngGhi chú: M: Ch th ADN,  đây dùng ADN ca thc khun th Lambda ct bng enzym gii hn
HindIII. Sn phm PCR có đ dài 480bp, s dng cp mi PLAF - PLAR. ng chy 1 - 9: sn phm PCR,

4
TCNCYH 38 (5) - 2005

(
vi khuôn pha long gp đôi t s 1 (1000 vi
khun); đn đng s 9 (khong 4 vi khun) vn
có sn phm PCR dng tính mi tên ch dn)

Vi kt qu kho sát đ nhy phn ng PCR đã
đt đc, chúng tôi thy có th xây dng phng

IV. BÀN LUN
Do thành phn cp mi PLAF - PLAR đc thit
k da trên chui gen pla, gen đc hiu riêng ca
plasmid pPCP1, mà plasmid này li thuc s hu
duy nht ca vi khun dch hch Yersinia pestis,
cho nên tính đc hiu ca cp mi này là rt cao.
iu này đc chng minh bng kt qu ca
chúng tôi là phn ng PCR vi cp mi PLAF -
PLAR là ht sc đc hiu và rt nhy, đc thc
hin thành công ngay c khi vi lng ADN (các
loi) có hàm lng rt thp, 0,1 - 0,6ng hay
khong 1 - 10 vi khun nguyên vn làm khuôn.
Mc dù đc pha loãng vào trong đt và nc
và thc hin phn ng PCR, trong môi trng đt
- nc gi nghim có vi khun dch hch nh th
này,  nng đ pha loãng vi s lng ch cn
khong 4 vi khun làm khuôn, phn ng PCR chn
đoán s có mt ca chúng vn cho kt qu dng
tính.
Chúng tôi cho rng, vic chn đoán mt loi vi
sinh vt gây bnh có s hu plasmid đc lc nh
vi khun dch hch vi pPCP1, phng pháp tt
nht và chính xác nht vn là phát hin gen “đc
lc” ca chúng nm trên loi plasmid đó. Phng
pháp ca chúng tôi phù hp vi đnh hng chn
đoán trc tip bng PCR trên các gen “đc lc”
ca các plasmid c
ng sinh  vi khun gây bnh, đã
đc thc hin trong nhng nm gn đây trên th
gii [5,11].

đon (Restriction)". Tp chí Y hc thc hành, s
10 (432 + 433), tr. 29 - 31.
3. Lê Thanh Hoà (2003a). “Các loi plasmid
ca vi khun dch hch (Yersinia Pestis) và ng
5
TCNCYH 38 (5) - 2005
dng chn đoán phân t ti Vit Nam”, tr 69 - 78.
Sách: "T khoa hc sinh hc phân t đn cuc
sng và chm sóc sc kho". Báo cáo khoa hc
Hi ngh Sinh hc phân t và Hoá sinh toàn quc.
Hà Ni, 22 - 24/10/2003. Nhà xut bn Nông
nghip, Hà Ni, Vit Nam, 384 trang.
4. Lê Thanh Hoà (2003b). Giám đnh phân
t vi khun gây bnh dch hch Yersinia pestis
(Lehmann and Neumann 1896) phân lp ti Vit
Nam s dng gen pla ca plasmid pPCP1. Tp chí
Y hc Vit Nam, 283(4): 1 - 11.
5. Chu, M.C. (2000). Laboratory Manual of
Plague Diagnostic Test CDC, 3rd edition, WHO, pp.
67 - 89.
6. Engelthaler, D. M., Hinnebusch, B. J.,
Rittner, C. M., Gage, K. L. (2000). Quantitative
competitive PCR as a technique for exploring Flea -
Yersina pestis dynamics. Am J Trop Med Hyg.
62(5): 552 - 560.
7. Hu, P., Elliott, J., McCready, P.,
Skowronski, E., Garnes, J., Kobayashi, A.
Brubaker, R.R, and Garcia, E. (1998).
Structural organization of virulence - associated
plasmids of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 180 (19):

based diagnostic kit was developed. Sensitivity and specificity of this kit was tested by PCR using diluted
genomic DNA and bacterium itself; and mix of these templates in water and soil as samples. Results: With
the diluted genomic DNA, it was successful to obtain specific PCR with 0,6ng template, which is equal to a
single bacterium. Additionally, successful PCR amplification was obtained using the whole bacterium
(without extraction of genomic DNA) and diluted quantity ranging from 101 to 102. Based on these results,
the bacterium was artificially diluted with sample of soil - water as a natural isolate for PCR amplification.
As a result, specific PCR product was obtained by 1 ng genomic and 4 bacteria per template.
Conclusions: Evidently, approach for PCR - based diagnostic kit was successfully carried out from any
template including soil - water samples with high fidelity, using the pla gene genetic marker of pPCP1 of Y.
pestis.
Keywords: plague, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, artificial experimentation.
6