39


tâm 2ml mới.
 Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet cho đến khi không còn
sự phân lớp
 Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hoà tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70
o
C (để
chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml không nắp.
40

 Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong
60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch còn lại.
 Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng bằng ethanol 95 – 100%
xuống còn 1X
 Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng
trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc
 Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hoà tan bằng pipet.
 Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube
1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ
dịch lọc.
 Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30
giây, loại bỏ dịch lọc.
 Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low
stringency.
 Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
 Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml có nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch
hoà tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo
quản ở 4
o
C.
3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di

 Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI
 Bƣớc 2: Vào Folder Blast
 Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào
 Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu
đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn)
3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR
RT – PCR hai bƣớc
Bƣớc 1: Reverse transcription
 Thành phần hoá chất

 Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl

 iScript Reaction Mix 4µ

 iScript Reverse Transcriptase 1µ

 Nuclease-free water 13µ

 RNA khuôn mẫu 2µ

Tổng thề tích 20µ

 Chu trình nhiệt cho phản ứng
1 chu kỳ 5 phút ở 94
o
C
30 chu kỳ 1 phút ở 94
o
C
1 phút ở 55
o
C
1 phút ở 72
o
C
1 chu kỳ 10 phút ở 72
o
C
Giữ ở 4
o
C trong 15 phút
 Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình
tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi mang tính chất
thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:
 Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55
o
C xuống 50
o
C; 48
o
C; 46
o

o
C trong 45 phút
1 chu kỳ 94
o
C trong 2 phút
45 chu kỳ 94
o
C trong 30 giây
50
o
C trong 1 phút
72
o
C trong 1 phút
1 chu kỳ ở 72
o
C trong 10 phút
1 chu kỳ ở 4
o
C trong 15 phút
3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di
 Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%
 Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60
o
C, sau đó đổ vào
khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc
44

 Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.
 Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu

10
12
14
Tỉ lệ (%)
Xã
Nhuận Đức
Phước Thạnh
Lộc Hưng

Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.

 Qua kết quả trên chúng tơi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại
hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) còn ở mức thấp, trái lại trên địa
bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút
TSWV (0%).
Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV

Nhuận Đức 91 11 12,1

Phƣớc Thạnh 32 4 12,5

Lộc Hƣng 12 0 0
46

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt
 Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tôi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm
vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nông dân nắm vững tên của
giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại công ty nào thôi, chứ
ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo
chẩn đoán là đã bị nhiễm virút TSWV

Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ông
Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền
Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)

 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ

Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà
Nguyễn Thị Liễu, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức ngày 15 tháng 3 năm 2005)