BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài:
NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato
spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA
VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001-2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
iii
LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm tạ
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình
dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập.
PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này.
TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này.
KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này.
Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
tập tốt nghiệp.
Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi
trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện.
Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập
mẫu.
Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi.
Thành kính ghi ơn
Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích.
Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày
hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005
Sinh viên thực hiện
Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra
- Nhuận Đức: 12,1%
- Phƣớc Thạnh: 12,5%
- Lộc Hƣng: 0%
Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng
- Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5%
- Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57%
- Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53%
v
- Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%
Tỷ lệ nhiễm trên trái
- Trái nhiễm: 33%
- Không nhiễm: 67% vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus
dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay
RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction
Genome L: Genome long
Genome M: Genome medium
Genome S: Genome short
N: Nucleocapside
cRNA: Complementary RNA
vRNA: Virion RNA
Tm: Melting temperature
2.1.3.2 Rễ ................................................................................................................... 2
2.1.3.3 Lá ................................................................................................................... 2
2.1.3.4 Hoa ................................................................................................................. 3
2.1.3.5 Quả ................................................................................................................. 3
2.1.3.6 Hạt .................................................................................................................. 3
2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt .................................................................................. 3
2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt ..................................................................................... 4
2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác .................................................... 4
2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt .................................................................. 9
viii
2.3.1 Nhiệt độ................................................................................................................ 9
2.3.2 Ánh sáng .............................................................................................................. 9
2.3.3 Ẩm độ .................................................................................................................. 9
2.3.4 Đất và dinh dƣỡng ............................................................................................... 9
2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) ............................................... 10
2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV ................................................................................. 10
2.4.2 Cấu trúc TSWV ................................................................................................. 10
2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh .............................................................................. 13
2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV ................................... 14
2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt ................................................................................. 14
2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học ......................................................................... 15
2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển ................................................................................. 16
2.10 Khống chế bệnh TSWV ......................................................................................... 16
2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV ......................................................................................... 18
2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị .................................................................................. 18
2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận .................................................................................... 18
2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống ................................................................................... 18
2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.......................................... 19
2.12 ELISA .................................................................................................................... 19
3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu ............................................................................ 36
3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36
3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV ....................................................................... 37
3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA ....................................................................... 37
3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA ................. 37
3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện ...................................................................................... 37
3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR ................................................................... 39
3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad ................................... 39
3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di .............................................. 40
3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR .......................................................... 40
3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR ......................................................................... 41
3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di ............................................................ 43
Phần IV. Kết quả Thảo luận ....................................................................................... 45
4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA ... 45
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra ................................................. 45
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt ............................................................. 46
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng ........................................................ 47
x
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi ............................................................... 50
4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR ................................................................................... 51
4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA ....................................................................................... 51
4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer ..................................................................................... 52
4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR.............................................................................. 53
4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR ........................................... 54
Phần V. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 60
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 60
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 60
Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61
PHẦN VII. PHỤ LỤC ................................................................................................. 64
Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV ................................................................. 46
Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong .................................................. 47
Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn ............. 47
Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ .......................................... 48
Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ .................................... 48
Hình 4.7: Kết quả điện di RNA ..................................................................................... 51
Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng ..................................................................... 53
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ........................................... 20
Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ........................................... 21
Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp .......................................... 21
Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp .......................... 22
Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA ........................................................................................... 34
1 Phần I
Mở Đầu
1.1 Đặt vấn đề
Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan
trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây
vừa nhƣ một loại rau, vừa nhƣ một loại gia vị.
Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin nhƣ: A,
B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác.
Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần
so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nƣớc ta
cây ớt đƣợc trồng với diện tích và sản lƣợng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong
nƣớc và xuất khẩu. Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị.
là: C.pendulum, C. pubescens, C. annum, C. frutescens, và C. chinensis, trong đó hai
loài C. pendulum và C. pubescens đƣợc trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài C.
chinensis đƣợc trồng ở khu vực Amazon và Châu Phi, hai loài C. annum và C.
frutescens đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới.
2.1.2 Nguồn gốc cây ớt
Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật học thì cây ớt có nguồn gốc từ Mehico
và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala. Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở
Guatemala mà ở Evraz.
Hiện nay ớt đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới và á nhiệt đới.
2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt
2.1.3.1 Thân
Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thƣờng mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng có
thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc lâu
năm nhƣng thƣờng đƣợc gieo trồng nhƣ cây hàng năm.
2.1.3.2 Rễ
Ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ. Tuy nhiên do việc cấy chuyển, rễ cọc
thƣờng bị đứt và cho một hệ rễ chùm phát triển, vì vậy nhiều ngƣời lầm tƣởng ớt có hệ
rễ chùm.
2.1.3.3 Lá
Thƣờng ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính. Lá có nhiều dạng khác nhau, nhƣng
thƣờng gặp nhất là loại lá mác, mép lá ít răng cƣa. Lông trên lá tùy thuộc vào các loại
khác nhau, một số có mùi thơm, lá thƣờng mỏng có kích thƣớc trung bình 1,5-
12cm×0,5-7,5cm.
3
2.1.3.4 Hoa
Các hoa hoàn thiện và quả thƣờng đƣợc sinh đơn độc trên từng nách lá. Hoa có thể
mọc thẳng đứng hoặc buông thòng. Trên cuống hoa thƣờng không có li tầng, hoa
thƣờng có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam, màu tím. Hoa có 5-7 cánh
hoa, cuống dài khoảng 1,5cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím,
Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh (trong 100g phần ăn đƣợc)
Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là
Capsaicin (C
18
H
27
NO
3
), hàm lƣợng của nó phụ thuộc vào giống. Quả còn chứa một
loại dầu có màu đỏ, không cay, năng suất chiết xuất 20-25% dịch chiết alkaloid. Quả
ớt xanh chứa nhiều rutin là một chất đƣợc dùng rộng rãi trong chế biến thuốc- y học.
(Nguyễn Hữu Trúc, 1995-2000)
2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác
Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng (Alfalfa)
biến dạng.
Bệnh virus đốm gân lá ớt
a. Mầm bệnh
Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp
b. Triệu chứng
Triệu chứng đặc trƣng nhất của bệnh là lốm đốm trên lá và gân lá có màu xanh
lục đậm. Ở một số giống ớt lá bị nhỏ lại và méo mó, trên một vài giống khác có thể
thấy các đốm vòng chết hoại. Sự nhiễm bệnh sớm làm cây lùn lại. Trái trên cây nhiễm
bệnh nhỏ đi và đôi khi biểu hiện lốm đốm và hơi biến dạng.
Bệnh virus gây khảm dƣa leo
a. Mầm bệnh
Bệnh do Cucumovirus gây ra, bệnh này đƣợc lan truyền bởi rệp.
b. Triệu chứng
Triệu chứng bệnh rất rõ ràng. Một trong số những biểu hiện phổ biến nhất là cây
lùn hẳn lại, không phát triển và có tàn lá màu xanh nhạt, đục có vẻ giống nhƣ da nhƣng
không có những dấu vết rõ rệt trên tàn lá. Đôi khi triệu chứng trên tàn lá rất rõ rệt và
có thể bao gồm: lá thu hẹp lại, khảm, hóa vàng, có đốm vòng vàng nhạt hoặc chết hoại,
biến dạng lá sồi. Trong một số trƣờng hợp, chồi ngọn bị chết hoại. Trên trái có thể
xuất hiện những vòng vàng nhạt hoặc chết hoại.
Bệnh virus đốm trên ớt
a. Mầm bệnh
Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp.
b. Triệu chứng
Các giống mẫn cảm phát triển triệu chứng lốm đốm trầm trọng trên lá và thƣờng
đi kèm theo triệu chứng gân xanh và biến dạng lá. Nhiều chủng virus gây biến dạng
mạnh trên trái.
Bệnh virus gây khảm nặng trên ớt
a. Mầm bệnh
Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp
Bệnh virus gây cong ngọn củ cải
a. Mầm bệnh
Bệnh do Geminivirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rầy lá. 7
b. Triệu chứng
Triệu chứng điển hình gồm có sự cong mép các lá già lên trên và mép lá non hơn
cong lên rất mạnh. Cuống lá cong nhiều về phía dƣới. Cây bị nhiễm bệnh vào những
giai đoạn đầu bị vàng và lùn rõ rệt. Sau khi nhiễm bệnh cây cho rất ít trái, những trái
có sẵn nhỏ lại, méo mó và chín ép. Cây bị nhiễm bệnh sớm trong vụ trồng thƣờng
không sống đƣợc.
Bệnh virus đốm lá ớt ngọt
a. Mầm bệnh
Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học
b. Triệu chứng
Triệu chứng trên lá gồm có: trong gân lá, khảm, lốm đốm và hoá vàng. Cây bị
nhiễm bệnh trong thời kỳ đầu có thể bị lùn lại. Khó phân biệt đƣợc triệu chứng do
virus này gây ra với triệu chứng do các tobamovirus.
Bệnh virus gây đốm nhẹ trên cây ớt (Bệnh khảm ớt hay bệnh khảm ẩn thuốc lá
Samsun)
a. Mầm bệnh
Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học
b. Triệu chứng
Triệu chứng khảm nhẹ phát triển khắp trên mặt lá và đôi khi lá bị nhăn nheo. Trái
thƣờng bị thiệt hại nặng với các triệu chứng nhƣ vòng, vệt thẳng, đốm chết hoại và
méo mó. Cây bị lùn khi bị nhiễm bệnh sớm vào thời kỳ đầu giai đoạn sinh trƣởng.
Bệnh virus khảm thuốc lá - Bệnh virus khảm cà chua
a. Mầm bệnh
Đặc điểm của bệnh Tigre’ là lá bị cong và hoá vàng rõ rệt mép lá và vùng thịt lá
giữa các gân. Lá bệnh nhỏ hẳn, nhăn nheo, mép lá cuốn ngƣợc lên trên. Cây nhiễm
bệnh trong những thời kỳ đầu bị lùn hẳn lại.
Bệnh virus gây khảm vàng Serrano
a. Mầm bệnh
Do Geminivirus, đƣợc lan truyền bởi bọ phấn
b. Triệu chứng
Sự xâm nhiễm của virus gây ra khảm vàng tàn lá ớt.
Bệnh geminivirus trên ớt Texas
a. Mầm bệnh
Geminivirus, virus này đƣợc lan truyền bởi bọ phấn 9
b. Triệu chứng
Cây bệnh biểu hiện triệu chứng cong lá và biến dạng. Mép lá có xu hƣớng cuốn
lên trên và xuất hiện các đốm vàng sáng, đôi khi các viền vàng lan vào trong các vùng
mô giữa gân lá. (Bùi Cách Tuyến)
2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt
2.3.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, số hoa, tỷ lệ đậu quả. Nhiệt độ ngày/đêm
khoảng 25/18 là thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển của ớt nói chung, tăng
năng suất, tăng số quả thƣơng phẩm. Nhiệt độ ban đêm thấp (8-15
o
C) thƣờng làm giảm
tỷ lệ đậu quả và sinh quả không hạt, nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20
o
C trong
giai đoạn nở hoa. Ngoài ra nhiệt độ thấp còn làm giảm kích thƣớc dạng quả. Nói
đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59-
90% điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng
mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến
các loại hoa màu nhiều nhất. (Lindsey Irons and Emily Sims)
2.4.2 Cấu trúc TSWV
TSWV là thành viên của giống Tospovirus, thuộc họ Bunya viridae là một nhóm
lớn virus chứa vật liệu di truyền là các sợi đơn RNA. TSWV là những tiểu phần nhỏ,
đƣờng kính 80-120nm. Genome của TSWV gồm một sợi RNA âm tính và hai sợi
RNA ambisense. Mỗi RNA của genome thì đƣợc bao bọc bởi nhiều bản copy của
Nucleocapside (N) để hình thành nên ribonucleoprotein cũng đƣợc biết nhƣ là
nucleocapside. Các nucleocapside đƣợc bao bọc bên trong lớp màng đôi đƣợc tạo ra từ
ký chủ và đi kèm với protein L phụ thuộc vào chuỗi RNA. Chúng để lộ các
glycoprotein ra ngoài bề mặt 5-10nm mà sau khi đã gắn vào lớp màng đôi lipid dày
khoảng 5nm. Tính trên thành phần tổng số thì RNA chiếm 2%; protein chiếm 58%;
lipid chiếm 33% và carbohydrate chiếm 7%. Chúng chỉ xuất hiện trong tế bào chất mà
không ở bất kỳ tổ chức nào. Theo một nhà khoa học thì có ba thuyết chính giải thích
về hình thể tròn của virus. Thứ nhất là nồng độ của khối khuếch tán bình thƣờng là rất
cao và đôi khi vỏ nucleoprotein của virus lại xoắn lại. Thứ hai là sự bao bọc các
nucleoprotein trần này bằng các màng để tạo nên virus trƣởng thành. Thuyết thứ ba là
sự cách ly với các phần của virus trong các buồng bên trong các lỗ trong màng hoặc
trong hệ thống lƣới nội chất là một phản ứng của cây ký chủ (cô lập chúng bằng cách
bao chúng lại).
Tất cả các virus thuộc họ này đều có ba đoạn genome RNA, đƣợc đặt tên là L
(long), M (medium), và S (short). Có thể số lƣợng thì không tƣơng đồng trong mỗi loại
virion bởi vì sự giống hay khác nhau về số lƣợng của các đoạn này là không có ý
nghĩa.
11
Đoạn genome L tạo ra một loại protein, đây là một polymerase. Các đoạn M tạo ra
các glycoprotein đƣợc đặt tên là G1 và G2. Đoạn genome S tạo ra các nucleoprotein.
(Peter Schreier, Prof. Dr. Martin Hülskamp, 2002)
13
Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV
(Biowave vol.6 No.23, 2004)
2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh
Con đƣờng xâm nhập và tái bản virus đƣợc thể hiện nhƣ hình vẽ, các đoạn RNA tái
bản từ đầu đến cuối. Đầu tiên là tấn công của hạt virion. Thứ hai là xâm nhập vào và
cởi bỏ lớp áo virus bằng sự ẩm thực bào của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus
và màng nhân. Thứ ba là sự sao mã sơ cấp xảy ra. Thứ tƣ là sự dịch mã của các đoạn
mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M
bởi các ribosome gắn trên màng và xảy ra sự glycozyl hoá đầu tiên các protein vỏ mới
đƣợc tạo ra. Giai đoạn thứ năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu
bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome
hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Tiếp đến là sự tái bản genome theo
sau là sự sao mã thứ cấp, tức là tổng hợp các loại mRNA và xuất hiện sự sao mã
ambisense. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong
tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa khối
tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành.
Copyright: Tài liệu đại học ©