Bộ Giáo dục và đào tạo
Khoa công nghệ sinh học
F G

KHểA LUN TT NGHIP Đề tài: Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng
thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di
truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ H NI - 2008
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

Phần I: Mở đầu

dạng nào và khả năng rủi ro đến với sức khoẻ con ngời, với sự đa dạng sinh
học, tiềm ẩn ô nhiễm môi trờng ở Việt Nam, đến nay vẫn đang trong thời
gian xây dựng và hoàn thiện các quy chế về quản lý an toàn sinh học các cây
chuyển gen và kiểm soát các sản phẩm biến đổi gen. Tuy nhiên, để đa nhanh
các cây chuyển gen vào sản xuất tại Việt Nam thì việc nghiên cứu tạo cây
chuyển gen, trồng thử nghiệm và kiểm soát cây trồng biến đổi gen cần phải tiến
hành trớc một bớc. Trong số các cây trồng biến đổi gen đang thử nghiệm thì
cây ngô đang rất đợc quan tâm nhất đặc biệt là ngô chuyển gen kháng thuốc
trừ cỏ.
Để đáp ứng các chỉ tiêu kỹ thuật trong việc phát hiện chính xác ngô
chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và nhanh chóng sử dụng các dòng ngô này phục
vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ của Việt Nam. Chúng tôi đã
thực hiện đề tài Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ
bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen
kháng thuốc trừ cỏ.
1.2. Mục đích
Thu thập dữ liệu về cây trồng biến đổi gen và tìm hiểu một cách tổng
quan về cây ngô chuyển gen .
Bớc đầu làm quen với các kỹ thuật nghiên cứu về cây chuyển gen
Xác định đoạn trình tự đặc trng của promoter CaMV-35S (195bp) có
trong ngô chuyển gen.
Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) là gen kháng
thuốc trừ cỏ glufosinate có trong ngô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Đánh giá đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông sinh học chính và đa dạng di
truyền ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RAPD của một số dòng ngô thuần
mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u
việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ.

-3-
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

Var. Huchuetenangensis Iltis & Doebly
Var. Parviglumis Iltis & Doebly subsp
Mexicana (Schrader) Iltis
Nòi Chalco
Nòi Cao nguyên trung phần
Nòi Nobogame

Z. mays subsp. mays

Từ loài Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đợc phân thành
các loài phụ, sau đó dựa vào màu hạt và màu lõi để phân các thứ (varieta).
Những loài phụ chính bao gồm:
Zea mays Subsp. indurata
- ngô đá
Zea mays Subsp. indentata
- ngô răng ngựa

-4-
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -5-
Zea mays Subsp. ceratina
- ngô nếp
Zea mays Subsp. saccharata
- ngô nếp
Zea mays Subsp. everta
- ngô bột
Zea mays Subsp. amylacea
- ngô bột

độ cao 3900m, ở Bắc Carolia (34
P
o
P
-37P
o
P
bắc) trồng đợc ở 1200m, ở Châu á nh
thung lũng Kasmir ở 2000m, còn ở Châu Âu (khoảng 45
P
o
P
-48P
o
P
bắc) ở độ cao
500-800m.
Trên phạm vi thế giới, các nhà khoa học đã chia sinh thái cây ngô thành 4
vùng chính:
Ôn đới
Cận nhiệt đới
Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển)
Nhiệt đới thấp (dới 2000m)
Theo phân loại này, Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp.
Các bộ giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu hiện sự thích ứng hơn cả thông qua
khả năng chống chịu và năng suất, kể cả ở các thảo nguyên cao phía Bắc hoặc
vụ đông ở Đồng bằng Bắc Bộ.
2.1.2. Nguồn gen và đa dạng di truyền cây ngô
Ngô là cây trồng đợc thu thập, mô tả và bảo tồn rất tốt từ các trung tâm
đa dạng di truyền. Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với các nớc Mỹ La

bông cờ và bắp. ở các đặc điểm của cây, sự biến động thể hiện ở chiều cao cây,
chiều cao đóng bắp và đặc điểm của lá (dài lá, chiều rộng lá, số lá trên cây, số lá
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -7-
trên bắp), màu thân và dạng lóng. Sự biến động ở cờ thể hiện ở độ dài bông cờ,
cuống bông cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai và ba, đờng kính bắp và số
hàng hạt. Đặc biệt sự biến động rất đa dạng ở nội nhũ hạt, từ đây ta phân biệt
các dạng răng ngựa, đá rắn, bột, đờng, nếp, nổ và bọc. Sự biến động còn thể
hiện ở kích thớc hạt, màu hạt và chất lợng hạt.
ở Việt Nam ngô là cây trồng nhập nội do vậy sự phong phú về nguồn gen
có hạn hẹp. Theo các nghiên cứu phân loại ngô địa phơng Việt Nam (GS.TS
Ngô Hữu Tình, 1995) từ những năm 60 đến nay cho thấy, ngô Việt Nam tập
trung chủ yếu vào hai loài phụ là đá rắn và nếp.
Ngày nay để đánh giá sự đa dạng di truyền của một loài, ngời ta không
chỉ dựa vào các đặc điểm thực vật học dễ nhận biết và riêng rẽ mà cần phân tích
trên cơ sở nhiều tính trạng để phân biệt các nhóm cách biệt di truyền thông qua
khoảng cách Ơclit hoặc khoảng cách Mahalanobis Gần đây công nghệ sinh
học đã góp phần rất đắc lực trong việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ
thuật Isozyme hoặc sự đa hình độ dài các phân đoạn cắt hạn chế (RFLP
Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình các đoạn khuếch
đại ngẫu nhiên)
2.1.3. Đặc điểm hình thái cây ngô
Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo. Ngô có
ba loại rễ chính: Rễ mầm, Rễ đốt (rễ phụ cố định), Rễ chân kiềng, chúng giúp
cây ngô hút nớc và các chất dinh dỡng từ đất.
Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân khá chắc, có đờng kính
từ 2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc. Thân có chiều
cao khoảng 1,5-4m. Thân ngô trởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm

của 2 năm (1985) và sau 20 năm đổi mới (2004) thấy rằng diện tích ngô tăng
2,5 lần, năng suất 2,3 lần và sản lợng 5,9 lần [1].
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -9-
Tuy nhiên, năng suất ngô của Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) vẫn còn
thấp hơn năng suất bình trung bình thế giới (48,5 tạ/ha), vẫn thấp hơn nhiều so
với Mỹ (100,0 tạ/ha) và Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song đã vợt đợc năng suất
bình quân khối các nớc đang phát triển (31,3 tạ/ha). Mặc dầu vậy, khách quan
mà nói: Sản xuất ngô Việt Nam trong thời kỳ đổi mới đã có sự phát triển vợt
bậc, toàn diện và đáng trân trọng.
2.2. Cây trồng biến đổi gen
2.2.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen hoặc cây trồng công nghệ sinh học là các cây
trồng đã đợc biến đổi về mặt di truyền nhằm làm cho cây trồng mang một số
đặc tính quý giá mà cây trồng tự nhiên không có. Công nghệ này cho phép các
gen riêng biệt đã chọn lọc đợc chuyển từ một cơ thể này sang một cơ thể khác
cũng nh giữa các loài không có liên quan với nhau. Các tính trạng thờng đợc
chuyển vào cây trồng nh tính kháng côn trùng, kháng nấm bệnh, kháng vi
khuẩn, kháng thuốc trừ cỏ, kháng mặn, cho năng suất cao, chất lợng sản phẩm
tốt. Đây là một phơng hớng quan trọng giải quyết vấn đề an toàn lơng thực
cho nhân loại góp phần giảm thiểu các loại nông dợc và phân bón hoá học, bảo
vệ môi trờng sinh thái bền vững.
Sự biến đổi về mặt di truyền thờng bao gồm sự chèn đoạn ADN, tái tổ
hợp những mảnh ADN nhỏ hơn vào trong hệ gen của cây trồng bị biến đổi. Cấu
trúc của gen chèn điển hình trong GMC (Genetically Modified Crops) đợc tạo
nên bởi 3 bộ phận:
1. Đoạn promoter (đoạn khởi động) có chức năng điều khiển hoạt động
của gen cấu trúc, nó đợc ví nh chiếc công tắc bật/mở để đọc gen chèn vào.

tăng sức đề kháng của vật nuôi đối với bệnh tật, tạo ra các loại thức ăn có chất
lợng dinh dỡng cao.
Lợi ích trong công nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm mới có chất
lợng dinh dỡng cao, mẫu mã đẹp, thời gian bảo quản lâu, hay làm thay đổi
hàm lợng acid béo trong dầu thực vật nhằm làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim
mạch đã đợc tạo ra nhờ công nghệ chuyển gen thực vật.
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -11-
Lợi ích trong công nghệ dợc phẩm: Nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp, ngời
ta có thể sản xuất ra các sản phẩm nh các kháng nguyên, các protein ngời,
hemoglobin, một số kháng thể từ cây trồng biến đổi gen.
Lợi ích về môi trờng: Năng suất của cây trồng biến đổi gen cao hơn rất
nhiều so với các cây trồng tự nhiên do đó sự phát triển của GMC sẽ làm giảm
nhu cầu chuyển đổi đất rừng và đất ở thành đất nông nghiệp. Làm giảm nhu cầu
sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ, bón đạm nh vậy sẽ làm giảm ô nhiễm
nguồn nớc và nguy cơ gây hại cho sức khoẻ con ngời.
Lợi ích về kinh tế: GMC đã và đang mang lại cho ngời nông dân nhiều
lợi ích về kinh tế, nó làm giảm chi phí sản xuất, giảm sức lao động và tăng giá
trị sản phẩm. Năm 2007, doanh thu từ GMC đạt 6,9 tỷ USD và dự định năm
2008 là 7,5 tỷ USD [42].
Lợi ích ngời tiêu dùng: Nhờ có công nghệ chuyển gen thực vật mà ngời
tiêu dùng có thể có đợc các sản phẩm thực phẩm có lợi hơn đối với con ngời
nh các sản phẩm có chất lợng dinh dỡng cao, có hơng vị, có thời gian bảo
quản lâu, hay đợc bổ sung một số chất nh vitamin A, vitamin E [12, 20].
Ngoài những lợi ích to lớn kể trên, khi đa GMC ra ngoài môi trờng
ngời ta đặc biệt quan tâm đến những ảnh hởng của nó đối với môi trờng và
sự cân bằng hệ sinh thái Thực tế đã cho thấy cây trồng biến đổi gen có ích lợi
tiềm tàng đối với môi trờng. Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi tự nhiên, sinh

gen
Mặc dù GMC đang đợc thơng mại hoá có nhiều đặc tính u việt hơn so
với các cây trồng cùng loại nhng do mới xuất hiện nên ngời ta cha đánh giá
hết đợc những ảnh hởng bất lợi của chúng. Vì vậy yêu cầu đặt ra khi thơng
mại hóa GMC và sản phẩm của chúng là chúng ta phải đặt vấn đề xem xét về
mức độ an toàn của các sản phẩm này lên hàng đầu. Vì thế bất kỳ một sản phẩm
chuyển gen nào trớc khi đợc đa ra thị trờng phải đ
ợc thử nghiệm toàn
diện, đợc các nhà khoa học và giám định viên đánh giá độc lập xem có an toàn
hay không về mặt dinh dỡng, độc tính, khả năng gây dị ứng và các khía cạnh
khoa học thực phẩm khác. Những đánh giá về an toàn thực phẩm này dựa trên
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -13-
những quy định của từng quốc gia. Chúng bao gồm: một hớng dẫn sử dụng sản
phẩm, một thông tin chi tiết về mục đích sử dụng sản phẩm, các thông tin về
phân tử, hoá sinh, độc tính, dinh dỡng, khả năng gây dị ứng
Do những rủi ro và những lo ngại bất thờng xung quanh quá trình biến
đổi di truyền mà việc bắt buộc dán nhãn các sản phẩm GMC đã trở thành một
yêu cầu và là quy định của nhiều quốc gia. Việc dán nhãn GMC cho phép ngời
tiêu dùng lựa chọn sản phẩm theo phong tục, tôn giáo, chế độ ăn hàng ngày của
họ vì nhiều tôn giáo không thích sử dụng các sản phẩm đợc tạo ra nhờ sự biến
đổi di truyền.
2.2.3. Tình hình sản xuất, sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Sau khi những kết quả nghiên cứu đầu tiên về cây trồng biến đổi gen đợc
công bố những năm 80 thế kỷ XX, sự phát triển của cây trông biến đổi gen có
những bớc đột phá quan trọng về những kết quả nghiên cứu và ứng dụng chúng
vào sản xuất:
Năm 1994, lần đầu tiên FDA (Cơ quan quản lý thực phẩm và dợc phẩm

Trong khoảng thời gian từ 2006 đến 2007, diện tích trồng cây CNSH ở các nớc
đang phát triển (8,5 triệu ha hay 21%) tăng cao hơn so với các nớc công nghiệp
(3,8 triệu ha hay 6%). Đáng chú ý là có 5 nớc lớn và đang phát triển đa cây
trồng CNSH vào canh tác, nằm ở 3 châu lục: Trung Quốc và ấn Độ ở Châu á,
Achentina và Braxin ở châu Mỹ Latinh, Nam Phi ở châu Phi; tổng dân số ở cả 5
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -15-
quốc gia này là 2,6 tỉ ngời, chiếm 40% dân số thế giới, trong đó có 1,3 tỉ ngời
sống hoàn toàn dựa vào nông nghiệp.
Bảng 1: Diện tích trồng cây CNSH năm 2007 phân theo nớc (đ/v: triệu ha)
TT Nớc trồng Diện tích trồng Loại cây biến đổi gen
1*

Hoa Kỳ
57.7
Đậu tơng, ngô, bông, cải, đu đủ, cỏ alfalfa
2*

Achentina* 19.1 Đậu tơng, ngô, bông
3*

Brazin*
15.0
Đậu tơng, ngô
4*

Canada* 7.0 Cải canola, ngô, đậu tơng
5*

14

Colombia 0.1 Bông, cẩm chớng
15 Chile <0.1 Ngô, đậu tơng, cải canola
16 Pháp <0.1 Ngô
17 Honduras <0.1 Ngô
18 Cộng Hoà Séc <0.1 Ngô
19 Bồ Đào Nha <0.1 Ngô
20 Đức
<0.1
Ngô
21 Slovakia <0.1 Ngô
22 Romania <0.1 Ngô
23 Phần Lan <0.1 Ngô
* 13 nớc đợc coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 héc-ta trở lên
Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hoá từ năm 1996
đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội. Năm 2007,
tính trạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải
canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích
đất trồng cây CNSH toàn cầu). Năm 2007, Hoa Kỳ, Achentina, Braxin, Canada,
ấn Độ và Trung Quốc tiếp tục là các nớc đa cây trồng CNSH vào canh tác
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -16-
nhiều nhất. Hoa Kỳ vẫn dẫn đầu thế giới với 57,7 triệu hecta (chiếm 50% diện
tích đất trồng cây CNSH trên thế giới), do nhu cầu ngày càng tăng của thị trờng
ngô dùng trong sản xuất cồn ethanol, diện tích trồng ngô CNSH tăng tới 40% -
mức tăng này đã phần nào bù lại mức giảm đôi chút đối với diện tích trồng đậu
tơng và bông CNSH. Đáng chú ý là 63% ngô CNSH, 78% bông CNSH và 37%

Kết quả đã thu đợc những cây trồng biến đổi gen và lu giữ chúng trong
điều kiện invitro và trong điều kiện nhà kính.
2.3. Cây ngô biến đổi gen
2.3.2. Tình hình sản xuất cây ngô biến đổi gen trên thế giới
Trên thế giới thì diện tích cây ngô biến đổi gen là lớn thứ 2 sau đậu tơng
với diện tích 25,2 triệu ha chiếm 25% diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế
giới. Cây ngô biến đổi gen đợc trồng nhiều nhất ở Mỹ, Achentina, Brazin,
Canada, China, Nam Phi, Uruguay, PhilippinCây ngô chủ yếu đợc nghiên
cứu, sản xuất và sử dụng giống có tính trạng chống chịu thuốc trừ cỏ, kháng sâu,
chịu hạn.
Năm 2006, thêm một số nớc thuộc liên minh Châu Âu (EU) lần đầu tiên
đa ngô Bt vào trồng đại trà. Tổng diện tích trồng ngô Bt ở 5 nớc (Pháp, Cộng
Hoà Séc, Bồ Đào Nha, Đức và Slovakia) đã tăng trên 5 lần từ xấp xỉ 1.500 ha
năm 2005 lên gần 8.500 ha năm 2006, diện tích này còn tăng lên rất nhiều trong
năm 2007.
Ngô là cây trồng đợc các quốc gia trên thề giới cấp phép sử dụng làm
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhiều nhất với tổng số 35 giống khác nhau, vợt
hẳn cây trồng đứng thứ 2 là bông (với 19 giống khác nhau). Giống ngô đợc cấp
phép nhiều nhất là ngô kháng sâu bệnh (MON 810) và ngô kháng thuốc trừ cỏ
(NK603), cả hai giống ngô đợc 18 nớc cấp phép.
Năm 2006, theo ớc tính của hãng phân tích thị trờng Cropnosis, thị
trờng cây trồng biến đổi gen toàn cầu trị giá khoảng 6,15 tỷ đô la, chiếm 16%
thị trờng cây trồng đợc bảo hộ trên toàn cầu và chiếm 21% thị trờng hạt
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -18-
giống toàn cầu. Trong đó giá trị của ngô biến đổi gen chiếm 39% tơng đơng
khoảng 2,39 tỷ đô la.
Do đặc tính sinh lý của cây ngô nên tỷ lệ đạt kết quả nghiên cứu chuyển
-19-
Khi đợc hỏi, bất cứ ngời nông dân nào cũng trả lời rằng cỏ dại luôn là
một vấn đề gây lo lắng cho họ. Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy
nớc, chất dinh dỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để mọc mà còn là nơi
c trú cho côn trùng và các loại sâu bọ gây bệnh, gây tắc nghẽn hệ thống tới
tiêu, làm giảm sút chất lợng mùa màng, và còn đem theo cả hạt giống cỏ vào
cây trồng đợc thu hoạch.
Thông thờng, nông dân sẽ cày bừa trớc khi trồng trọt nhằm làm giảm
số lợng cỏ dại trên cánh đồng. Sau đó họ phun thuốc diệt cỏ theo diện rộng để
làm cho cỏ dại không thể mọc đợc ngay trớc khi geo hạt. Biện pháp diệt cỏ
này rất tốn kém và việc cày xới đất sẽ khiến gió và nớc làm xói mòn lớp đất
phía trên bề mặt gây hậu quả nghiêm trọng kéo dài cho môi trờng. Ngoài ra,
một số thuốc diệt cỏ lại tồn tại dai dẳng trong môi trờng. Sự tạo thành các cây
trồng kháng thuốc diệt cỏ là một cách để khắc phục các yếu điểm đó.
Một số cải biến sinh học khác nhau có thể làm cho cây trồng trở nên
kháng thuốc diệt cỏ có thể nêu ra là:
Tạo ra một loại protein mới giải độc thuốc diệt cỏ.
Thay đổi protein mục tiêu của thuốc diệt cỏ do vậy mà protein này sẽ
không bị tác động bởi thuốc diệt cỏ.
Sản xuất quá mức protein mục tiêu nhạy cảm thuốc diệt cỏ sao cho vẫn có
d để duy trì các chức năng tế bào bất chấp sự có mặt của thuốc diệt cỏ.
Cho cây khả năng bất hoạt về mặt chuyển hoá thuốc diệt cỏ.
Ba cách đầu tiên là những cách phổ biến nhất mà các nhà khoa học dùng
để phát triển loại cây trồng chịu đợc thuốc diệt cỏ (bảng 2).
Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hóa từ năm 1996
đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội. Năm 2007,
tính trạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải
canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích đất


Glufosinat
(phosphinothrixin)

Tính kháng thuốc là do sự thay đổi gen psbA mã hoá
cho đích của thuốc diệt cỏ, protein lục nạp D-1.
Các gen mã hoá các dạng kháng của enzym axetolactat
synthetaza đã đợc đa vào lúa, cây dơng, cây lanh,
cây cải dầu
Các giống có các dạng enzym axetolactat synthetaza
kháng đã đợc chọn lọc trong nuôi cấy mô.
Các thuốc diệt cỏ này kìm hãm enzym axetyl coenzym
A carboxylaza. Sự kháng đợc chọn lọc trong nuôi cấy
mô, có đợc là do enzym thay đổi không nhạy cảm
thuốc diệt cỏ hoặc phân huỷ thuốc diệt cỏ.
Tính kháng do sản xuất quá mức EPSPS, đích của thuốc
diệt cỏ này. Tính kháng thuốc đợc cải biến bằng biến
nạp đặc trng với gen EPSPS kháng glyphosat và thuốc
lá với gen glyphosat oxidoreductaza mã hoá enzym phân
huỷ glyphosat.
Cây bông và thuốc lá có tính kháng đợc tạo thành bằng
biến nạp với gen tfdA từ Alcaligenes mã hoá
dioxygenaza phân huỷ chất diệt cỏ này.
Hơn 20 loại cây khác nhau đã đợc biến nạp với gen bar
từ Streptomyces hygroscopicus hoặc gen pat từ S.
Viridochromogenes. Phosphinothrixin axetyltransferaza
mà các gen này mã hoá khử độc thuốc diệt cỏ này.

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu


Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -22-
chế hoạt tính của enzym tổng hợp glutamin, enzym cần thiết cho sự tạo thành
glutamin và độc tính ammonia. Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm
lợng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật. Điều này làm cho quá
trình quang hợp ngừng và cây chết sau vài ngày.
Gen Bar mã hoá cho enzym phosphinothricin- N- acetyltransferase (PAT)
đợc phân lập từ chủng Streptomyces hygroscopicus HP632. Ngoài việc cung
cấp tính trạng kháng thuốc trừ cỏ, gen mã hoá enzym PAT còn đợc sử dụng
nh marker chọn lọc để xác định các cây đã chuyển gen trong suốt quá trình tái
sinh nuôi cấy mô. làm cho thành phần hoạt tính trong thuốc trừ cỏ glufosinate là
phosphinothricin không hoạt động, cho phép các cây trồng sống sót trong khi
mà ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết.
2.4.3. Một số dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ
Event Bt16
Phơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.
Dòng Bt16 đợc cải biến di truyền để kháng thuốc trừ cỏ ammonium-
glufosinate (hay phosphinothricin), thnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ
Basta, Finale, Buster, Harvest v Liberty. Ammonium-glufosinate l một chất
diệt cỏ có phổ rộng, không chọn lọc. Nó đợc sử dụng để kiểm soát cỏ dại sau
khi cây mọc hoặc kiểm soát thảm thực vật mọc trên đất m chúng không sử
dụng cho mục đích gieo trồng. Nó có thể bị vi khuẩn phân huỷ ở mức độ cao,
không có hoạt tính d thừa, v mức độ độc tính đối với con ngời v động vật
rất thấp. Khả năng chống chịu glufosinate trong dòng ny l do gen bar, gen
ny mã hoá cho enzym phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) m cho
phép các cây trồng ny sống sót trong khi m ứng dụng khác của glufosinate có
thể gây chết.
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu

Phơng pháp biến nạp: Chuyển nạp nhờ súng bắn gen.
TC1507 đợc cải tiến di truyền để kháng côn trùng v thuốc trừ cỏ
glufosinate. Dòng ny chứa gen cry1F - l protein cry1F của côn trùng có nguồn
gốc từ B. thuringiensis var. aizawai. Protein ny có hiệu quả trong việc kiểm
soát ấu trùng của nhiều loi sâu bọ phổ biến ở ngô chẳng hạn nh sâu đục thân
ngô Châu Âu, sâu đục thân ngô Tây Bắc, sâu ngi đen, sâu cắn gié. Dòng
TC1507 có khả năng chống chịu ammonium glufosinate l do chuyển gen PAT
vo genome của dòng ny.

Hình 5: Plasmid PHI8999A đã đợc sử dụng để tạo ra event TC1507
2.5. Các phơng pháp phát hiện cây trồng biến đổi gen
Việc nhận biết GMC có rất nhiều ứng dụng nh để đánh giá mức độ sạch
của Cây giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia.
Có rất nhiều kỹ thuật đã và đang đợc phát triển để đáp ứng nhu cầu này. Nhận
biết GMC và dẫn xuất của nó có thể đợc thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử mà
những phân tử này có nguồn gốc từ gen đợc chèn [13, 14]. Có 3 phơng pháp
để xác định GMC đó là:

Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -25-
1. Phơng pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit:
Bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP
(Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleic (NASBA),
các kỹ thuật RFLP, AFLP, RAPD
- Dựa trên cơ sở ARN: Nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và
phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp (gọi là primer). Thờng thì sự liên kết giữa
ARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hoá phân tử ARN thành ADN thông qua
quá trình sao chép ngợc. Cuối cùng ADN có thể đợc nhân lên nhờ kỹ thuật