BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA
CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri
PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ
VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2003 – 2007
SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ HÙNG DŨNG
TS. NGUYỄN VĂN HẢO LÊ HÙNG DŨNG
Th.S. NGUYỄN DIỄM THƢ
Th.S. NGUYỄN THỊ HIỀN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

iii
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban
chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng.
TS. Nguyễn Văn Hảo đã hết lòng hƣớng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực
tập tốt nghiệp tại Viện.
Th.S. Nguyễn Diễm Thƣ, Th.S. Nguyễn Thị Hiền, Th.S. Nguyễn Mạnh
Thắng, KS. Nguyễn Thị Mộng Hoàng, KS. Phạm Hồng Lan, KS. Lê Văn Tám, KS.
Nguyễn Thị Hồng Vân, KS. Hà Thị Ngọc Nga đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ cho tôi
trong suốt quá trình thực tập.
Ban Giám Đốc Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ,
và các anh chị công nhân viên chức Trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình thực tập.
Các bạn sinh viên Đại học Nha Trang lớp Nuôi Trồng Thủy Sản một, hai
khoá 2003 – 2008, các bạn sinh viên Đại học An Giang khoá 2004 - 2008, các bạn

năng sinh miễn dịch của các loại vacxin trên. Những kết quả đạt đƣợc:
 Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả,
không có tính an toàn.
 Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bƣớc đầu thử nghiệm có độ an toàn, có
khả năng tạo sức đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch cho cá tra mang mầm
bệnh đốm trắng. Nồng độ vacxin thích hợp cho cá tra với chất bổ trợ phèn
chua là 3x10
9
CFU/cá.
v
ABSTRACT
In recent years, freshwater sutchi catfish, Pangasius hypophthalmus,
becomes one of aqua-species with highly economic value in Mekong Delta.
However, diseases had been occurred, particularly the white spot disease (WSD)
with typical signs such as white spots of different sizes on liver, kidney and spleen.
The outbreak in Tra-catfish caused unbenefied for fish farms. To reduce the risks
for Tra-catfish farm as well as the antibiotics overused, we carry out this topic:
“Determination of immune response on Tra-catfish and the efficacy of different
vaccines against Edwardsiella ictalluri isolated from different areas and times in
Mekong Delta”. This topic was performed from 3 to 8/2007 in Research Institute
for Aquaculture II.
After collecting fish samples in different areas on fish farms, biochemical
tests and PCR analyses, challenge test to identify 50% lethal dose (LD
50
) of
Edwardsiella ictalluri in wetlab. We carried out the experiments on vaccines with
oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG and alum adjuvant to evaluate the
immunizarion and safety of these vaccines. The results showed that:
 Vaccine with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG is not effective and
safe.

2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas .....................5
2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas .........................................6
2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella .................................6
2.2.1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng ............................................................7
2.2.2 Bệnh ký sinh trùng ..............................................................................9
2.2.2.1 Bệnh trùng bánh xe ....................................................................9
2.2.2.2 Bệnh trùng quả dƣa ...................................................................10
2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo ...................................................................10
2.2.2.4 Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh ................................................10
2.2.2.5 Bệnh do giun sán nội ký sinh ...................................................11
2.2.2.6 Bệnh rận cá ...............................................................................11
2.2.3 Bệnh nấm thủy mi .............................................................................11

vii
2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh ...........................................................12
2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ...............................................12
2.3.2 Các loại vacxin: .................................................................................12
2.3.2.1 Vacxin bất hoạt (chết)...............................................................12
2.3.2.2 Vacxin sống nhƣợc độc ............................................................13
2.3.2.3 Vacxin DNA .............................................................................13
2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin ..................................................................13
2.3.3.1 Trên thế giới .............................................................................13
2.3.3.2 Tại Việt Nam ............................................................................14
2.3.4 Các phƣơng pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá .....................15
2.3.4.1 Tiêm ..........................................................................................15
2.3.4.2 Ngâm ........................................................................................15
2.3.4.3 Cho ăn .......................................................................................15
2.3.5 Giới thiệu sơ lƣợc về chất bổ trợ .......................................................16
2.3.5.1 Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ ..........................................16
2.3.5.2 Các loại chất bổ trợ thông dụng ................................................16

4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá ......................................37
4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể ............40
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 44
5.1 Kết luận ..................................................................................................44
5.2 Đề nghị ...................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 46
1. Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................46
2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài .........................................................................47
3. Tài liệu từ internet ....................................................................................47
PHỤ LỤC ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long
TCB : Thức ăn chế biến
TACN : Thức ăn công nghiệp
Viện NC NTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
NAVETCO : Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ƣơng 3
TBVK, tbvk : Tế bào vi khuẩn
CFU : Colony form unit
LD50 : Lethal dose 50%
ĐC : Đối chứng


xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2. 1. Hình thái cá tra .......................................................................................... 4
Hình 2. 2. Cá tra nhiễm bệnh đốm trắng ..................................................................... 7
Hình 2. 3. Vi khuẩn Edw. ictaruli dƣới kính hiển vi quang học ................................. 8
Hình 2. 4. Cá tra bệnh ................................................................................................ 8
Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá ....................................................................................... 22
Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá ................................................................................. 23
Hình 3. 3. Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận ........................................................ 23
Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết .................. 25
Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm .......................................................... 26
Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng ................................................................... 32
Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng ......................................................... 32
Hình 4. 3. Cá có biểu hiện xuất huyết bên ngoài ...................................................... 38
Hình 4. 4. Cá có dấu hiệu xuất huyết xoang bụng .................................................... 38
Hình 4. 5. Cá có nhiều đốm trắng trên thận .............................................................. 38
Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả
vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu .................................................................................. 34
Biểu đồ 4. 2. Thể hiện tỉ lệ cá chết các nghiệm thức của thí nghiệm 3 ................... 41
ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc
ĐBSCL" 2

1.2 Mục đích và yêu cầu
Xác định tính sinh miễn dịch của các loại vacxin và hiệu quả của chúng đối
với vi khuẩn Ed. ictaluri đƣợc phân lập trên cá tra ở các vùng địa lí vào các thời
điểm khác nhau:
 Xác định hiệu quả của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70 M-PG
và chất bổ trợ phèn chua về độ an toàn, khả năng tạo đáp ứng miễn
dịch và khả năng bảo hộ trên cá tra đối với vi khuẩn Ed. ictaluri.
 Sử dụng phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể đối
với thí nghiệm dùng chất bổ trợ phèn chua. 3

bụng. Vây hậu môn tƣơng đối dài. Thân cá có màu xám hơi xanh trên lƣng, bụng có
màu trắng hơi bạc (Phạm Văn Khánh, 2000).
Hình 2. 1. Hình thái cá tra (Phạm Văn Khánh, 2000)
2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng
Sau khi nở đƣợc 14 ngày cá có chiều dài từ 2 - 2,3 cm và nặng 0,25 g. Cá tra
5 tuần tuổi có chiều dài 5 - 6 cm, nặng 1,28 - 1,50 g/con. Sau một năm đạt 0,7 – 1,5
kg/con và sau 3 - 4 năm đạt 3 - 4 kg/con (Phạm Văn Khánh, 1997).
2.1.3 Đặc điểm sinh sản
Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 - 4 năm, thƣờng sinh sản vào
tháng 5 - 7 hàng năm. Cá tra có tập tính bơi ngƣợc dòng đến các bãi đẻ, nơi có điều
kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục. Các bãi đẻ thƣờng nằm
ở vùng Kratie của Campuchia (www.fistenet.com.vn).
Cá mẹ nặng 8 – 10 kg/con có sức sinh sản thực tế 3 - 6 vạn trứng/con, cá
nặng 3,2 kg/con có sức sinh sản tƣơng đối 139 - 150 ngàn trứng/con (Phạm Văn
Khánh, 1997).
Trong sinh sản nhân tạo, cá đƣợc nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn
trong tự nhiên, cá tra có thể phát dục 1 – 3 lần trong một năm (Phạm Văn Khánh,
2000).

5

2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra
Gần đây, diện tích và sản lƣợng nuôi cá tra, basa ở vùng ĐBSCL càng mở
rộng. Đối tƣợng nuôi này không chỉ là kế sinh nhai của hàng triệu ngƣời dân, mà

cũng có thể dùng các loại kháng sinh (Oxytetracyline, Streptomycin, Sulfamid,
Kanamycin) trộn vào thức ăn để trị bệnh cho cá (Phạm Văn Khánh và Lý Thị
Thanh Loan, 2005).
2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas (bệnh đốm đỏ)
- Tác nhân gây bệnh: P. fluorescens, P. anguiliseptica, P. chlororaphis (Bùi
Quang Tề và ctv., 1999).
- Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp
mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhƣng không xuất
huyết vây và hậu môn, Pseudomonas spp. xâm nhập vào cơ thể sẽ phá hủy các mô,
các chức năng trong cơ thể, khi các cơ quan bị phá hủy có thể gây chết đến 70 -
80% (Từ Thanh Dung, 1994).
- Phòng trị: Giảm mật độ nuôi, cung cấp nguồn nƣớc tốt, tắm 3 - 5 ppm KMnO
4

trong một khoảng thời gian, có thể dùng các loại kháng sinh để điều trị nhƣ trong
bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan,
2005).
2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis)
- Tác nhân gây bệnh: Do Edwardsiella tarda (Bùi Quang Tề và ctv., 1999).
- Dấu hiệu bệnh lý: Xuất hiện những vết thƣơng nhỏ trên da, đƣờng kính
khoảng 3 – 5 mm. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị tƣa rách.
Có thể xuất hiện những vết thƣơng bên dƣới biểu bì, cơ, các vết thƣơng này sẽ gây
hoại tử vùng cơ chung quanh. Bệnh xuất hiện khi chất lƣợng nƣớc trong môi trƣờng
nuôi xấu, nuôi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển khoảng 30
0
C
(Từ Thanh Dung, 1994).
- Phòng trị: Giữ sạch môi trƣờng nƣớc nuôi, giảm mật độ nuôi, có thể dùng các
loại kháng sinh để điều trị nhƣ trong bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm
Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005).


+ Vi khuẩn Ed. ictaluri thuộc họ Enterobacteriacea phân lập từ cá tra là vi
khuẩn gram âm (-), không di động, lên men, không oxy hoá. Cho phản ứng catalase
dƣơng tính, âm tính trong phản ứng oxidase (Từ Thanh Dung và ctv., 2003). Theo
Plumb (1993) vi khuẩn Ed. ictaluri phát triển tốt ở 28 – 30
o
C. Vi khuẩn này đƣợc
phân lập lần đầu tiên trên cá nheo Mỹ (Hawke, 1979). Tuy nhiên, những biểu hiện
bệnh lý trên cá nheo hoàn toàn khác so với trên cá tra nhiễm bệnh (Từ Thanh Dung
và ctv., 2003).

Hình 2. 3. Vi khuẩn Edw. ictaruli dƣới kính hiển vi quang học Hình 2. 4. Cá tra bệnh
- Dấu hiệu bệnh lý: Bệnh hoại tử cơ quan nội tạng ở cá tra đƣợc mô tả với biểu
hiện bệnh là các điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan của cá tra,
đƣờng kính dao động từ 1 - 3 mm. Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao, xảy

3
hoặc tắm cho cá bệnh nồng độ 2 – 5
g/m
3
trong 30 phút. Dùng muối ăn 2 – 3% tắm cho cá 5 – 15 phút hoặc dùng
formol liều lƣờng 20 ppm tắm cho cá từ 5 – 15 phút (Từ Thanh Dung, 1994).
10

2.2.2.2 Bệnh trùng quả dƣa
- Tác nhân gây bệnh: Do một giống tiêm mao trùng Ichthyophthiosis (Lê Nhƣ
Xuân và ctv., 1994).
- Dấu hiệu bệnh lý: Trùng ký sinh trên da, mang và vây của cá, bám thành các
hạt lấm tấm rất nhỏ, đƣờng kính từ 0,5 – 1 mm. Đồng thời, da và mang cá có nhiều
nhớt màu sắc nhợt nhạt (Phạm Văn Khánh và ctv., 2005). Bệnh phát triển tốt ở nhiệt
độ 22 – 25
o
C (Từ Thanh Dung, 1994).
- Phòng và trị bệnh: Định kỳ vệ sinh ao nuôi, không thả cá với mật độ quá dày.
Dùng Malachite green liều lƣợng 0,1 – 0,3 g/m
3
phun xuống ao cá bệnh hay 1 – 2
g/m
3
tắm cá trong 30 phút (Từ Thanh Dung, 1994).
2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo
- Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh gồm các loài thuộc giống Lernaea, có
dạng giống mỏ neo. Ký sinh trên cá là con cái trƣởng thành, thân dài 8 -16 mm.
Nhiệt độ trùng phát triển là 26 – 28
o
C (Bùi Quang Tề và ctv., 1999).

- Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh là một số loài thuộc giống Argulus và
Alitropus (Bùi Quang Tề và ctv., 1999).
- Dấu hiệu bệnh lý: Rận cá ký sinh trên thân, da, vây xoang bụng và mang cá
hút máu làm da bị tổn thƣơng, sƣng đỏ tạo điều kiện cho tác nhân gây hại khác tấn
công (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005).
- Phòng trị bệnh: Dùng thuốc tím với nồng độ 5 – 10 g/m
3
trong thời gian 15 –
30 phút (Từ Thanh Dung, 1994).
2.2.3 Bệnh nấm thủy mi
- Tác nhân gây bệnh: Do hai giống nấm là Saprolegnia và Achlya (Từ Thanh
Dung, 1994).
- Dấu hiệu bệnh lý: Khi cá mắc bệnh, trên da cá xuất hiện những vùng trắng
xám, trên đó có các sợi nấm nhỏ, mềm, tua tủa (Từ Thanh Dung, 1994). Sau vài
ngày sợi nấm phát triển đan chéo vào nhau thành búi trắng nhƣ bông có thể thấy
bằng mắt thƣờng (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994).
- Phòng trị bệnh: Áp dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp: ao ƣơng nuôi
phải đƣợc tẩy dọn kỹ, làm tốt công tác kỹ thuật nuôi, cách li cá bệnh để tránh sự lây
lan (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). Trị bệnh cho cá: tắm cá bệnh
12

trong nƣớc muối 0,5 – 1 kg/100 lít nƣớc cho cá hƣơng và 2 – 3 kg/100 lít nƣớc cho
cá lớn trong 10 – 15 phút (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994).
2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh
2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Để hiểu rõ tác dụng của vacxin trƣớc hết chúng ta cần tìm hiểu về nguyên lí
cơ bản của sự kích thích đối với hệ thống miễn dịch đặc hiệu. Khả năng đáp ứng
miễn dịch hay miễn dịch đặc hiệu gồm hai dạng:
+ Miễn dịch dịch thể: Khi có kháng nguyên vào cơ thể hai loại tế bào
lympho T và B cùng tham gia vào quá trình tiêu diệt kháng nguyên. Tế bào lympho

chứa gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh.
Trong thủy sản, vacxin DNA đƣợc tập trung nghiên cứu là vacxin phòng các bệnh
virus (Gudding và ctv., 1999).
2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin
2.3.3.1 Trên thế giới
Vacxin cho cá đƣợc dùng thử vào những năm 30 của thế kỷ trƣớc để nâng
cao sức đề kháng cho cá chống lại dịch bệnh chủ yếu là trên đối tƣợng cá hồi. Tuy
nhiên, tới những năm 1970, do sự gia tăng các nông trại cá đặc biệt là các nông trại
cá nƣớc mặn, thì vacxin đƣợc chú trọng phát triển hơn nhằm ngăn ngừa, kiểm soát
bệnh và vacxin đã đƣợc thƣơng mại hóa từ thời gian này. Lý do dùng vacxin là do
điều trị hóa trị liệu tốn nhiều chi phí, hiệu quả của thuốc kháng sinh chỉ trong thời
gian ngắn, nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh và đồng thời với những hiểu biết rõ
ràng hơn về hệ thống miễn dịch của cá và về yếu tố độc lực chuyên biệt của mầm
bệnh cá, những điều đó thúc đẩy sự nghiên cứu và sản xuất vacxin. Đầu tiên là
những nghiên cứu về hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá với các vi khuẩn Vibrio
anguillarum, Pseudomonas punctata, Bacterium salmonicida. Hiện nay, vacxin
thƣơng mại cho năm vi khuẩn: Y. ruckeri, V. anguillarum, V. orrdalii, A.
salmonicida và V. salmonicida gây ra bệnh Vibriosis của cá vùng lạnh, vacxin này
chống lại các mầm bệnh do vi khuẩn Y. ruckeri, V. anguillarum, V. orrdalii sản xuất
14

bởi Công ty Colorado, Wildlife Vaccines, Inc., đƣợc cho phép bởi USDA (United
States Department of Agriculture) năm 1976. Mặc dù khi đó thành phần kháng
nguyên kích thích sinh kháng thể của vacxin không đƣợc biết rõ, nhƣng vacxin này
vẫn đƣợc dùng phổ biến. Vacxin có hiệu quả với nhiều đƣờng sử dụng khác nhau
nhƣng đƣợc cấp phép cho phƣơng pháp ngâm do có thể gây miễn dịch cho một
lƣợng lớn cá nhỏ, không phải thao tác nhiều dẫn đến giá lao động thấp và tránh
đƣợc stress cho cá. Đến 1981, vacxin kháng A. salmonicida cũng đƣợc sản xuất bởi
công ty trên, vacxin này ở ba hình thức: chỉ có một kháng nguyên A. salmonicida,
kháng nguyên A. salmonicida với Y. ruckeri, hoặc với V. anguillarum và V. orrdalii.