1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG
LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA
FLORFENICOL ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Edwardsiella
ictaluri
GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA TẠI ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PHẠM THỊ LINH MỤI
MSSV:06803021
Lớp NTTS K1
Cần Thơ, 2010
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG
LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA
FLORFENICOL ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Edwardsiella
ictaluri
GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA TẠI ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Th.s LÂM PHÚC NHÂN PHẠM THỊ LINH MỤI

Phòng Thí Nghiệm Chi Cục Thủy Sản TP. Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ cho em suốt thời gian
làm đề tài.
Em xin chân thành cám ơn quý thầy cô – Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Tây Đô
đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức qúy báu trong những năm học vừa qua,
tạo dựng hành trang để em bước vào cuộc sống sau này.
Xin cám ơn tất cả cô chú, anh chị trong Chi Cục Thủy Sản Thành Phố Cần Thơ đã tận tình chỉ
dẫn, giúp đỡ và đóng góp ý kiến bổ ích để hoàn thành thực tập tốt nghiệp.
Chân thành cám ơn tất cả các bạn trong lớp NTTS K1 trong thời gian qua luôn ủng hộ, động
viên để hoàn thành thực tập tốt nghiệp.
Em xin cám ơn Cha, mẹ, anh, em tôi đã luôn động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.
Với sự hiểu biết còn hạn hẹp và thu thập tài liệu còn hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp không
tránh khỏi sự sai sót. Kính mong được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn.
Em xin chân thành cám ơn và ghi nhớ!
PHẠM THỊ LINH MỤI
5
CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và kết
quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất kỳ luận văn cùng cấp nào khác.
PHẠM THỊ LINH MỤI
Ngày: ………………
6
TÓM TẮT
M
ụ
c tiêu c
ủ
a nghiên c
ứ
u là xác đ

ng Tháp. K
ế
t
qu
ả
phân l
ậ
p ki
ể
m tra các ch
ỉ
tiêu c
ơ
b
ả
n và đ
ị
nh danh b
ằ
ng b
ộ
kit API 20E xác đ
ị
nh đ
ượ
c 10
ch
ủ
ng
E. ictaluri

ạ
i (30 µg) và đ
ĩ
a kháng sinh t
ự
t
ạ
o
ở
các n
ồ
ng đ
ộ
(50
µg, 70 µg, 90 µg, 110 µg, 130 µg, 150 µg) và ph
ươ
ng pháp pha loãng thu
ố
c kháng sinh trong môi
tr
ườ
ng l
ỏ
ng theo ph
ươ
ng pháp Broth (Geert Huys, 2002) nh
ằ
m xác đ
ị
nh đ

ủ
ng vi khu
ẩ
n nh
ạ
y v
ớ
i
đ
ĩ
a kháng sinh florfenicol 30 µg, 60% ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n nh
ạ
y
ở
90 µg và 90% ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
nh
ạ
y v
ớ
i 110 µg. K
ế
t qu

n
E. ictaluri
nh
ư
ng v
ớ
i n
ồ
ng đ
ộ
thu
ố
c kháng sinh cao h
ơ
n n
ồ
ng đ
ộ
florfenicol chu
ẩ
n.
T
ừ
khóa:
Edwardsiella ictaluri
, florfenicol, gan th
ậ
n m
ủ
, cá tra.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

2
1.3 Nội dung nghiên cứu

2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3
2.1 Đặc điểm sinh học cá tra

3
2.2. Một số nghiên cứu trên vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri

3
2.2.1.
Đặ
c đi
ể
m sinh lý, sinh hóa c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri

.3
2.2.2. Phổ loài cảm nhiễm và phân bố của vi khuẩn
E.ictaluri

3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

9
8
2.2.3 Hóa chất thí nghiệm

9
3.3. Phương pháp nghiên cứu

9
3.3.1. Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ả
o qu
ả
n và v
ậ
n chuy
ể
n

9
3.3.2. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

10
3.3.3. Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ


ẩ
n
E.ictaluri

17
4.3 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên các chủng vi khuẩn
E. ictaluri

19
4.4 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn
E. ictaluri

22
4.5 So sánh tính nh
ạ
y c
ủ
a vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
ở
hai t
ỉ
nh An Giang và
Đồng Tháp

24
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT



20
B
ả
ng 4.5 B
ả
ng Giá tr
ị
MIC c
ủ
a 10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E. Ictaluri

23
10
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Công th
ứ
c c
ấ
u t
ạ
o florfenicol

6

μ
g, 90
μ
g và 110
μ
g

22
Hình 4.6: K
ế
t qu
ả
giá tr
ị
MIC c
ủ
a kháng sinh florfenicol lên ch
ủ
ng
vi khu
ẩ
n E10077

24
Hình 4.7:
Đườ
ng kính vô trùng (mm) c
ủ
a vi khu
ẩ

p
ở
An Giang (A) và
Đồ
ng Tháp (B)

26
11
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Đồng bằng sông cửu long ĐBSCL
Edwardsiella ictaluri E. ictaluri
Edwardsiella ictaluri
10058 E10058
Edwardsiella ictaluri
10059 E10059
Edwardsiella ictaluri
10063 E10063
Edwardsiella ictaluri
10064 E10064
Edwardsiella ictaluri
10066 E10066
Edwardsiella ictaluri
10068 E10068
Edwardsiella ictaluri
10073 E10073
Edwardsiella ictaluri
10074 E10074
Edwardsiella ictaluri
10075 E10075
Edwardsiella ictaluri

t Nam đã có nh
ữ
ng b
ướ
c phát tri
ể
n nhanh và
ổ
n đ
ị
nh góp
ph
ầ
n quan tr
ọ
ng vào s
ự
t
ă
ng tr
ưở
ng c
ủ
a n
ề
n kinh t
ế
qu
ố
c dân. T

n đã
tr
ở
thành ngành kinh t
ế
quan tr
ọ
ng, góp ph
ầ
n chuy
ể
n đ
ổ
i c
ơ
c
ấ
u nông nghi
ệ
p nông thôn, tham
gia xóa đói gi
ả
m nghèo, c
ả
i thi
ệ
n cu
ộ
c s
ố

u Long đ
ố
i t
ượ
ng cá n
ướ
c ng
ọ
t đ
ượ
c nuôi nhi
ề
u nh
ấ
t là cá tra. Cá tra đ
ượ
c xem là m
ộ
t trong
nh
ữ
ng m
ặ
t hàng th
ủ
y s
ả
n xu
ấ
t kh

ụ
cá tra, mà d
ấ
u hi
ệ
u rõ nét
nh
ấ
t là s
ự
s
ụ
t gi
ả
m di
ệ
n tích nuôi và t
ổ
ng giá tr
ị
kim ng
ạ
ch xu
ấ
t kh
ẩ
u.
Theo báo cáo c
ủ
a C

di
ệ
n tích và 80,0% s
ả
n l
ượ
ng
c
ủ
a c
ả
n
ướ
c. Trong đó, riêng di
ệ
n tích nuôi cá tra là 6.788 ha v
ớ
i s
ả
n l
ượ
ng đ
ạ
t 998.255 t
ấ
n (
Đỗ
H
ả
i Linh, 2009).

ầ
n Th
ơ
đã làm kháng sinh đ
ồ ở
n
ồ
ng đ
ộ
30

g/đ
ĩ
a, v
ớ
i
n
ồ
ng đ
ộ
này đã không kìm hãm đ
ượ
c s
ự
phát tri
ể
n c
ủ
a vi khu
ẩ

c n
ồ
ng đ
ộ
t
ố
i thi
ể
u. Chính vì th
ế
đ
ề
tài “
Xác
đị
nh n
ồ
ng
độ ứ
c
ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a florfenicol
đố

u
Xác đ
ị
nh hàm lu
ợ
ng
ứ
c ch
ế
t
ố
i thi
ể
u c
ủ
a florfenicol đ
ố
i v
ớ
i vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
gây
trên cá tra nh
ằ
m làm c
ơ
s
ở

ộ
i dung nghiên c
ứ
u
Phân l
ậ
p, đ
ị
nh danh vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
trên 10 m
ẫ
u cá tra b
ệ
nh.
L
ậ
p kháng sinh đ
ồ
10 ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n trên v
ớ
i kháng sinh florfenicol.
Xác đ
ị

O TÀI LI
Ệ
U
2.1
Đặ
c
đ
i
ể
m sinh h
ọ
c cá tra
B
ộ
siluriformes
H
ọ
Pangasidae Bleeker, 1858
Gi
ố
ng
Pangasianodon
Rainboth, 1996
Loài
P.hypophthalmus
Sauvage, 1878
Cá tra
Pangasianodon hypophthalmus
phân b
ố ở

ề
n,
cá tr
ưở
ng thành ch
ỉ
th
ấ
y
ở
trong ao tù n
ướ
c đ
ọ
ng, nhi
ề
u ch
ấ
t h
ữ
u c
ơ
, oxy hòa tan th
ấ
p và có th
ể
nuôi v
ớ
i m
ậ

ă
m. Trong t
ự
nhiên, cá tra
là loài
ă
n t
ạ
p, cá
ă
n đ
ượ
c mùn bã h
ữ
u c
ơ
, r
ễ
cây sinh v
ậ
t, rau qu
ả
, tôm tép, cua, côn trùng,
ố
c và cá
Cá 3 ngày tu
ổ
i
ă
n phiêu sinh đ

m sau
cá l
ớ
n nhanh h
ơ
n, có th
ể
đ
ạ
t 25 kg
ở
cá 10 tu
ổ
i.
2.2 M
ộ
t s
ố
nghiên c
ứ
u trên vi khu
ẩ
n
Edwardsiella ictaluri
2.2.1
Đặ
c
đ
i
ể

ắ
n, kích th
ướ
c 0,75 x 1,5-2,5

m. Theo
k
ế
t qu
ả
nghiên c
ứ
u c
ủ
a Plumb (1993) thì vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
c
ũ
ng có d
ạ
ng hình que th
ẳ
ng
nh
ỏ
nh
ư
ng kích th

ph
ả
n
ứ
ng
ở
oxidase, phát tri
ể
n t
ố
t
ở
28
0
C và phát tri
ể
n y
ế
u
ở
37
0
C (T
ừ
Thanh Dung và
ctv
,
2004).
T
ừ

ạ
o thành
khu
ẩ
n l
ạ
c tr
ắ
ng đ
ụ
c.
Đặ
c đi
ể
m sinh hóa vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
cho h
ầ
u h
ế
t các ph
ả
n
ứ
ng âm tính,
ch
ỉ
có 2 ph

c
Đ
oan (2006) cho th
ấ
y
15
vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
ph
ả
n
ứ
ng d
ươ
ng tính GLU (Glucose) còn các đ
ườ
ng khác MAN, INO,
SUR, RHA, SAC, MEL, AMY và ARA đ
ề
u âm tính, vi khu
ẩ
n còn cho ph
ả
n
ứ
ng âm tính v
ớ
i

đ
ượ
c phân l
ậ
p đ
ầ
u tiên trên cá Nheo M
ỹ
b
ở
i Hawker (1979). Sau đó Austin
(1999) đã phát hi
ệ
n ra vi khu
ẩ
n này gây b
ệ
nh nhi
ễ
m trùng máu c
ấ
p tính trên cá Nheo M
ỹ
gây t
ỉ
l
ệ
hao
h
ụ

) và trong môi tr
ườ
ng n
ướ
c Thái Lan (trích d
ẫ
n b
ở
i Kasornchandra,
1987). N
ă
m 2003,
ở
Indonesia nhóm nghiên c
ứ
u c
ủ
a Yuasa
et al
c
ũ
ng l
ầ
n đ
ầ
u tiên ch
ứ
ng minh
Edwardsiella ictaluri
là tác nhân gây b

ệ
nh
Vào nh
ữ
ng n
ă
m 2004, theo nghiên c
ứ
u c
ủ
a
Đỗ
Th
ị
Hòa và
ctv
cá b
ị
nhi
ễ
m vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
thu
ờ
ng có bi
ể
u hi
ệ

ố
cá có m
ắ
t l
ồ
i, đ
ụ
c m
ộ
t hay c
ả
hai bên m
ắ
t (Nguy
ễ
n
H
ữ
u Th
ị
nh và
ctv
, 2007).
K
ế
t qu
ả
nghiên c
ứ
u mô h

ấ
t to, th
ậ
n có hi
ệ
n t
ượ
ng nh
ũ
n, t
ỳ
t
ạ
ng s
ư
ng ít l
ớ
n. Trên
gan, th
ậ
n, t
ỳ
t
ạ
ng xu
ấ
t hi
ệ
n nhi
ề

ừ
10-90% t
ổ
ng s
ố
cá nuôi trong bè. Ngoài
ra còn m
ộ
t s
ố
vùng b
ị
xung huy
ế
t đ
ộ
ng m
ạ
ch và t
ĩ
nh m
ạ
ch gan, nh
ữ
ng c
ụ
m vi khu
ẩ
n xu
ấ

Đặ
c bi
ệ
t là h
ệ
th
ố
ng mao m
ạ
ch, hi
ệ
n t
ượ
ng này làm cho t
ổ
ch
ứ
c gan s
ư
ng to.
Ở
th
ậ
n c
ũ
ng xãy
ra hi
ệ
n t
ượ

ạ
i t
ử
. S
ự
ho
ạ
i t
ử ở
t
ỳ
t
ạ
ng
ả
nh h
ưở
ng nghiêm tr
ọ
ng đ
ế
n h
ệ
mi
ễ
n d
ị
ch
c
ủ

ng, nh
ữ
ng c
ơ
quan khác nh
ư
mang, c
ơ
, tim không có nh
ữ
ng
bi
ế
n đ
ổ
i l
ớ
n khi cá b
ị
b
ệ
nh tr
ắ
ng gan. Tuy nhiên
ở
mang có hi
ệ
n t
ượ
ng s

n
E. ictaluri
có th
ể
nhi
ễ
m cho cá b
ằ
ng hai đ
ườ
ng khác
nhau. Vi khu
ẩ
n trong n
ướ
c có th
ể
qua đ
ườ
ng m
ũ
i c
ủ
a cá xâm nh
ậ
p vào c
ơ
quan kh
ứ
u giác và di

ườ
ng này thì vi
khu
ẩ
n vào mao m
ạ
ch trong bi
ể
u bì gây ho
ạ
i t
ử
và m
ấ
t s
ắ
c t
ố
c
ủ
a da. Cá da tr
ơ
n còn nhi
ễ
m
E.
ictaluri
qua đ
ườ
ng mi

có th
ể
xâm nh
ậ
p vào
c
ơ
th
ể
cá t
ừ
môi tr
ườ
ng n
ướ
c qua da, qua mang cá và mi
ệ
ng b
ằ
ng đ
ườ
ng th
ứ
c
ă
n gây b
ệ
nh m
ủ
gan (Trích b

kỳ" của chloramphenicol một kháng sinh của nhóm phenicol, nhưng hiện nay
chloramfenicol đã cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam. Theo Dowling
(2006) vì chloramphenicol có độc tính rất mạnh và là nguyên nhân gây ra hiện tượng
thoái hóa tỷ xương. Tuy nhiên, dẫn xuất Florinated của kháng sinh này, đã được thay
thế là florfenicol và nhanh chóng được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi và thực
phẩm, bao gồm ngành thủy sản (Dowling 2006; Michel et al, 2003; Wrzsinsk et al,
2005).
Công thức hóa học C
12
H
14
Cl
2
FNO
4
S (2,2-dichloro-N-((1R,2S)-3-fluoro-1-hydroxy-1-
(4-(methylsulfonyl)phenyl)propan-2-yl)ethanamide).
Đặ
c tính
Florfenicol tan t
ố
t trong dimethylformamide, methanol, ít tan trong acid acetic và khó tan
trong n
ướ
c (Zhejiang Hioar pharmaceutical Co.,LTD.) (Trích b
ở
i Lê Th
ị
C
ẩ

ộ
t s
ố
tr
ườ
ng h
ợ
p v
ớ
i đi
ề
u ki
ệ
n nh
ấ
t đ
ị
nh v
ớ
i n
ồ
ng đ
ộ
cao
h
ơ
n. Thu
ố
c có tác d
ụ

ẩ
n Gram âm, Gram d
ươ
ng (Bùi Th
ị
Tho, 2003).
H
ì
nh
2.1
C
ô
ng
th
ứ
c
c
ấ
u
t
ạ
o
florfenicol
18
C
ơ
ch
ế
Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với
tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin. Vì vậy ức

s
ả
n
.
Ở
Th
ụ
y
Đ
i
ể
n, florfenicol là s
ự
l
ự
a ch
ọ
n đ
ầ
u tiên trong vi
ệ
c phòng tr
ị
b
ệ
nh cho cá b
ộ
t rainbow
trout do vi khu
ẩ

u tr
ị
r
ấ
t hi
ệ
u qu
ả
trên đ
ộ
ng v
ậ
t th
ủ
y s
ả
n
ở
Nh
ậ
t B
ả
n,
ở
Ireland, florfenicol c
ũ
ng đ
ượ
c
khuy

. Ngoài ra, kháng sinh
Aquaflor (50% florfenicol) đ
ượ
c khuy
ế
n cáo s
ử
d
ụ
ng v
ớ
i li
ề
u l
ượ
ng 20 mg/kg th
ể
tr
ọ
ng /ngày
(t
ươ
ng đ
ươ
ng 10mg/florfenicol/kg th
ể
tr
ọ
ng/ngày), dùng trong 10 ngày liên ti
ế

ở
i Lê Th
ị
C
ẩ
m Tú, 2009). T
ươ
ng t
ự
, Bowker (2002) c
ũ
ng đi
ề
u tr
ị
hi
ệ
u qu
ả
b
ệ
nh trên cá h
ồ
i do vi khu
ẩ
n
Oncorhynchus clarki lewisi
và
Flavobacterium
psychrophilum

ượ
ng 10 mg/kg cá /ngày, cho
ă
n
liên t
ụ
c trong 10 ngày theo Gaunt
et al
(2004); Gaunt và
et al
(2006) đã xác đ
ị
nh là có hi
ệ
u qu
ả
đ
ể
kh
ố
ng ch
ế
vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
gây b
ệ
nh ESC ph
ổ

ố
nghiên c
ứ
u nh
ư
Crumlish (2002) thì vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
phân l
ậ
p
trên cá tra b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ ở Đ
BSCL nh
ạ
y hoàn toàn v
ớ
i thu
ố
c kháng sinh florfenicol
(Crumlish, 2002 trích d
ẫ
n b
ở
i Nguy

ng pháp xác đ
ị
nh n
ồ
ng đ
ộ ứ
c ch
ế
t
ố
i
thi
ể
u (MIC
≤
0.25 µg/ml) thì tác gi
ả
cho r
ằ
ng thu
ố
c flofenicol còn nh
ạ
y hoàn toàn v
ớ
i vi khu
ẩ
n
E. ictaluri
phân l

phân l
ậ
p t
ừ
cá
tra
ở
t
ỉ
nh Trà Vinh đã kháng v
ớ
i florfenicol (MIC
50
= 2 µg/ml và MIC
90
= 4 µg/ml).
Dù nh
ữ
ng nghiên c
ứ
u g
ầ
n đây cho th
ấ
y tính nh
ạ
y c
ủ
a thu
ố

nuôi cá tra
ở Đ
BSCL có s
ử
d
ụ
ng florfenicol trong đi
ề
u tr
ị
b
ệ
nh cá. Chính vì th
ế
, đ
ể
tránh
hi
ệ
n t
ượ
ng l
ờ
n thu
ố
c c
ủ
a vi khu
ẩ
n

ng vào th
ự
c t
ế
tr
ị
b
ệ
nh cho cá
tra b
ệ
nh gan th
ậ
n m
ủ
.
20
CH
ƯƠ
NG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Th
ờ
i gian và
đị
a
đ
i
ể
m nghiên c

ầ
n Th
ơ
3.2 V
ậ
t li
ệ
u nghiên c
ứ
u
3.2.1
Đố
i t
ượ
ng thí nghi
ệ
m
Các ch
ủ
ng vi khu
ẩ
n
E.ictaluri
phân l
ậ
p t
ừ
cá tra (
Pangasianodon hypophthalmus
) b

y, đèn c
ồ
n, gi
ấ
y, bút lông, pipet (100
μ
l, 1000
μ
l,
5 ml) chai n
ấ
u môi tr
ườ
ng (250 ml và 500 ml), đ
ĩ
a petri,
ố
ng nghi
ệ
m, g
ă
ng tay,
ố
ng tiêm, lame,
lamella, kính hi
ể
n vi
Gi
ấ
y nhôm, đ

khác: N
ồ
i thanh trùng b
ằ
ng áp su
ấ
t (autoclave), t
ủ
c
ấ
y, t
ủ ấ
m, t
ủ
thanh trùng khô, t
ủ
l
ạ
nh, cân đi
ệ
n t
ử
(4 s
ố
l
ẻ
, Nh
ậ
t).
3.2.3 Hóa ch

ụ
l
ụ
c A.3)
Đĩ
a kháng sinh florfenicol th
ươ
ng m
ạ
i (30 µg) (Hãng OXOID), và đ
ĩ
a gi
ấ
y t
ự
t
ạ
o
ở
các n
ồ
ng đ
ộ
50
μ
g, 70
μ
g, 90
μ
g, 110

ố
i sinh lý, c
ồ
n 70
0
C
3.3 Ph
ươ
ng pháp nghiên c
ứ
u
3.3.1 Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ả
o qu
ả
n và v
ậ
n chuy
ể
n
Ph
ươ
ng pháp thu m
ẫ
u b
ệ

ự
a theo tài li
ệ
u Vi
ệ
n Nghiên C
ứ
u S
ứ
c Kh
ỏ
e
Độ
ng v
ậ
t Th
ủ
y
S
ả
n Thái Lan (AAHRI) (1993):
- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSA (lấy mẫu bệnh phẩm trực tiếp từ gan,
thận, tỳ tạng).
- Ủ mẫu trong tủ ấm từ 48 giờ. Lặp lại thao tác này đến khi đạt đĩa cấy thuần.
- Quan sát hình d
ạ
ng màu s
ắ
c khu
ẩ

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho
vào 5 ml nước muối sinh lý.
- Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ô CIT, VP và GEL.
- Tương tự cho vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ô ADH, LCD, ODC, H
2
S và
URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ô này. Tiếp theo dùng dung dịch
vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ô còn lại.
- Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28
0
C.
- Đọc kết quả sau 48 giờ.
- Đọc kết quả:
 Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu không cần thêm thuốc thử.
22
 Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử:
 Cho một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết quả sau vài giây.
 Cho một giọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết quả sau vài giây. Cho
một giọt thuốc thử VP1 sau đó cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ô VP,
đọc kết quả sau 10-15 phút.
 Trước khi đọc kết quả, bộ kit API 20E phải đạt tối thiểu 3 chỉ tiêu cho
kết quả dương tính. Ngược lại cần ủ mẩu thêm vài giờ.
 Sau khi cho thuốc thử vào thì đậy nắp khay nhựa lại.
 Khi đã cho thuốc thử vào các chỉ tiêu rồi thì không nên ủ lại trong tủ ấm.
 Kiểm tra kết quả test API 20E (Bảng A.2 và phụ lục A.3).
3.3.3 Ph
ươ
ng pháp ki
ể
m tra kháng sinh

ướ
c th
ự
c hi
ệ
n:
Dùng que c
ấ
y ti
ệ
t trùng l
ấ
y vi khu
ẩ
n cho vào
ố
ng nghi
ệ
m ch
ứ
a 5 ml n
ướ
c mu
ố
i sinh lý
ti
ệ
t trùng l
ắ
c đ

m bông ti
ệ
t trùng nhúng vào trong
ố
ng nghi
ệ
m ch
ứ
a vi khu
ẩ
n và quét lên đ
ĩ
a agar đ
ể
kho
ả
ng 1 phút.
Dán các đ
ĩ
a kháng sinh vào đ
ĩ
a agar sao cho kho
ả
ng cách 2 đ
ĩ
a kháng sinh là 24 mm, kho
ả
ng
cách gi
ữ

ờ
xu
ấ
t hi
ệ
n các vòng tròn không có vi khu
ẩ
n phát tri
ể
n (vòng vô trùng)
ở
m
ỗ
i đ
ĩ
a kháng
sinh đo đ
ườ
ng kính c
ủ
a vòng vô trùng xác đ
ị
nh tính nh
ạ
y c
ả
m c
ủ
a vi khu
ẩ

Ngày thứ ba
Pha thuốc: Pha hai ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50 ml (là thuốc kháng sinh hay
thuốc cần khảo nghiệm) (ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm và ống thứ
hai có hàm lượng thuốc là 256 ppm). Thuốc phải được pha bằng Ethanol.
Pha loãng thuốc với độ pha loãng hai lần từ 2-1024 ppm trong ống nghiệm 50 ml.
Hàm lượng thuốc 512 và 256 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024 ppm)
bằng cách thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64, 32, 16, 8, 4 và 2 ppm
được pha từ ống gốc thứ 2 (256 ppm) (Phụ lục A.4 Bảng A.3).
Lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Điều cần chú ý là
ở mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nữa sau khi cho dung dịch vi
khuẩn vào.
Đo mật độ vi khuẩn
Đo mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm và điều
chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0.1+0.02 (Khoảng 10
8
cfu/ml).
Lưu ý: đối chứng sử dụng khi so màu là môi trường NB, không dùng nước cất và
không nên cho khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo mật độ.
Cho 2ml vi khuẩn, đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống nghiệm có hàm lượng thuốc
từ 2-1024 ppm (Bảng A.2 và phụ lục A.4). Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi cho
vào các ống nghiệm có thuốc.
Mỗi lần xác định MIC cần phải có: Đối chứng âm (2 ml NB + 2 ml nước cất); đối
chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28°C trong 48 giờ.
Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ được cấy lên môi trường TSA để
kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong cùng điều kiện với các ống MIC.
Ngày thứ 4: Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA. Nếu phát
hiện thấy có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống

E10059 Xuất huyết vi, nhiều đốm
trắng ở gan, thận, tỳ tạng, thận nhũn
Tròn nhỏ, trắng đục
E10063 Xuất hiện nhiều đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng. Tròn nhỏ, trắng đục
E10064 Xuất huyết quanh mắt, thận, tỳ tạng
nhiều đốm trắng
Tròn nhỏ, trắng đục
E10066 Phù đầu, phù mắt xuất huyết, gan, thận nhiều
đốm trắng
Tròn nhỏ, trắng đục
E10068 Thận, gan, tỳ tạng nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10073 Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10074 Bên ngoài nhợt nhạt, gan thận nhiều đốm trắng. Tròn nhỏ, trắng đục
E10075 Gan, thận, tỳ tạng sưng to có nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục
E10077 Gan, tỳ tạng, thận nhũn có nhiều đốm trắng Tròn nhỏ, trắng đục

Trích đoạn So sánh tính nhạy của vi khuẩn E.ictaluri ở hai tỉnh An Giang và

---