TCNCYH 29 (3) - 2004

9
Nghiên cứu sự nhân lên tối u của dòng virut Rota
VNHR 203-030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta
Lê Thị Luân
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin

VNHR 203-30 là chủng virut rota ngời G4P6,8; đợc phân lập từ bệnh phẩm phân có nguồn gốc
từ bệnh nhi nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm 2000. Chủng này là ứng cử
viên để sản xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em Việt Nam. Liều gây nhiễm trên tế bào thận
khỉ tiên phát Macaca Mulatta là 0,1 FFU/1 tế bào.

i. Đặt vấn đề
Việt Nam là nớc đang phát triển có dân
số gần 80 triệu ngời, với tỷ lệ sinh hàng năm
lớn (1,52 triệu trẻ em sơ sinh trong 1 năm) và
tỷ lệ tử vong ở trẻ dới 5 tuổi cao (42,5 trẻ/
1000 trẻ /năm hay 9880 trẻ bị chết /năm)
trong số đó có 15,4% là do bị tiêu chảy [5].
Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy trong 5
năm 1998 đến 2003 tại các bệnh viện lớn của
nớc ta thì tiêu chảy do căn nguyên virut rota
chiếm 45% đến 60% trẻ vào viện do tiêu
chảy. Nếu tỷ lệ chết do virut rota cũng theo tỷ
lệ đó hoặc một nửa tỷ lệ đó thì tỷ lệ tử vong do
nguyên nhân này là 4% đến 8% trong tổng số
trẻ em dới 5 tuổi/năm. Nh vậy trong suốt 5
năm đầu tiên cứ 280-560 trẻ có 1 trẻ chết do
virut rota/năm [5]. Đối với trẻ vào viện, tối

dụng nh văcxin từ chủng G1P8 (Rotarix) của
hãng Glaxo Smith Lines; G10P12 của Lan
Châu Trung Quốc; G3P6 của
Australia;.G1,G2,G3,G4P8 (RotateqT) của
Merk,
Cùng với các nớc trên thế giới, nớc ta
thực hiện giám sát bệnh tiêu chảy do virut
rota từ năm 1998 và đã xác định đợc 4
chủng chính gây bệnh đó là: G1; G2; G4; và
G9 [5]. Chủng G1 và G2 đã đ
ợc cấy chuyển
và nhân lên trên tế bào [1,3] nhng chỉ có
chủng virus rota G4P6,8 là thích nghi trên tế
bào thận khỉ tiên phát. Chủng G4P6,8
(VNHR203) phân lập từ trẻ nam 9 tháng tuổi
vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm
2000. Chủng này đợc cấy chuyển thích nghi
30 lần trên các dòng tế bào thích hợp, đặc
biệt là tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta để tạo chủng cho nghiên cứu sản
TCNCYH 29 (3) - 2004

10
xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em
nớc ta. Để virut này nhân lên trên tế bào
thận khỉ có hiệu giá tối u trong nghiên cứu
sản xuất văcxin, điều nhất thiết phải tìm liều
gây nhiễm thích hợp. Do vậy mục tiêu duy
nhất của nghiên cứu này là xác định liều gây
nhiễm để tạo hiệu giá cao nhất khi nhân

0
C
hoặc -80
0
C. Chúng đợc đông tan 3 lần, sau
đó ly tâm 3000 vòng/1phút/10phút. Lấy nớc
nổi và chuẩn độ hiệu giá virus rota từ các mẫu
thu đợc bằng phơng pháp miễn dịch huỳnh
quang nh sau:
Bớc 1: Nuôi tế bào MA104 một lớp trên
phiến nhựa 96 giếng, đáy phẳng (sản xuất tại
Đan Mạch-loạt số 047016). Rửa tế bào bằng
2 lần môi trờng muối cơ bản Hank và 1 lần
bằng môi trờng 199 có chất ổn định pH
(heppes), giữ phiến tế bào với môi trờng 199
tại 37
0
C đến khi gây nhiễm virut.
Bớc 2: Hoạt hóa virut VNHR-203-030
bằng dung dịch trysin IX (Gibco-Mỹ) tại 37
o
C
từ 30 đến 60 phút.
Pha loãng virus bậc 10 bằng môi trờng
199 hoặc DMEM có heppes và không có
huyết thanh bê.
Bớc 3: Hút hết môi trờng 199 tại các
giếng tế bào, cho 100àl hỗn dịch virus nồng
độ từ 10
-1

Hiệu giá virut (FFU/ml)= n x1/ log 10
-x
x
10.
Trong đó: n là số lợng điểm huỳnh
quang.
10
-x
là nồng độ pha loãng nhất có thể đếm
đợc điểm huỳnh quang.
10 là hệ số tính hiệu giá trong 1ml.
TCNCYH 29 (3) - 2004

11
iii. Kết quả
Kết quả nghiên cứu đợc trình bầy trong
các bảng sau:
Bảng 1. Hiệu giá chủng VNHR-203-030
Hiệu giá
Chủng
Log10
n
FFU/ml
VNHR-203-030 7,0

Bảng 1 cho kết quả hiệu giá chủng
VNHR203-030 là 10
7,0
FFU/ml
Bảng 2. Hiệu giá của virus rota trên các

khi số lợng tế bào tăng và hiệu giá thấp nhất
là 100 tế bào/FFU.
iv. Bàn luận
Tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta
là tế bào đợc tách từ tổ chức thận khỉ
Macaca Mulatta (khỉ nuôi tại đảo Rều Quảng
Ninh) và có thể cấy chuyển 3 lần liên tiếp. Mỗi
đôi thận khỉ có thể tách đợc khoảng 100-120
chai roux tế bào. Tế bào này đợc nuôi và
phát triển kín 1 lớp bằng môi trờng LHE 10%
huyết thanh bê trong 7 ngày. Khỉ lấy thận
đợc kiểm tra nghiêm ngặt về các tác nhân
ngoại lai theo phơng pháp và tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới. Khỉ và tế bào thận khỉ
đợc chấp nhận để nghiên cứu và sản xuất
văcxin khi đã qua tất cả thử nghiệm theo yêu
cầu của Tổ chức Y tế thế giới.
Tế bào (MA104) có nguồn gốc từ tế bào
thận bào thai khỉ rherus, đợc chọn lọc tạo
thành dòng tế bào thờng trực, dòng tế bào
có thể cấy chuyển nhiều lần mà không ảnh
hởng đến đặc tính của tế bào, đợc bảo
quản ở -196
0
C và đợc cung cấp bởi Trung
tâm Phòng chống và Kiểm soát bệnh tật
CDC-Atlantta-Mỹ, là nguồn tế bào nhạy cảm
cho sự nhân lên của virus rota và dùng để sử
dụng cho phân lập và kiểm tra hiệu giá virut
rota.

tốt nhất trên tế bào thận khỉ tiên phát khi liều
gây nhiễm là 0,1 đơn vị miễn dịch huỳnh
quang trên một tế bào (0,1FFU/ 1 tế bào).
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này là công trình nghiên cứu
lần đầu tiên tại nớc ta về virut rota, nghiên
cứu đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm
chuẩn tại Trung tâm Khoa học Sản xuất
Văcxin Sabin, số 135 phố Lò Đúc-Hà Nội.
Nghiên cứu này là một trong những nội dung
giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota tại Việt
Nam năm 2003 đề tài hợp tác với Trung tâm
Phòng chống và Kiểm soát Bệnh tật (CDC)
Atlantta-Mỹ và dới sự tài trợ của Tổ chức Y
tế thế giới và của Trung tâm Khoa học Sản
xuất Văcxin Sabin. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới Gs. Nguyễn Văn Mẫn chủ nhiệm
đề tài hợp tác, đã tạo mọi điều kiện cho tôi
chủ động thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin
chân thành cảm ơn tới: Ts. Nguyễn Thị Quỳ;
Ts. Nguyễn Đăng Hiền; Cn. Lê Trung Dũng;
Cn Trần Bích Hạnh và Cn. Nguyễn ánh Tuyết
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin
đã giúp tôi thực hiện nghiên cứu này.
Tài liệu tham khảo
1. Lê Thị Luân. Quá trình chọn lọc chủng
virut rota týp G2 trên nuôi cấy tế bào. Tạp chí Y
học thực hành; Số 9 (460); Trang 13-15; 2003
2. Lê Thị Luân. Nuôi cấy virut rota gây
bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em dới 5 tuổi trên tế