BKHCN-BYT
VVSDT TƯ
BKHCN-BYT

VVSDT TƯ

BKHCN-BYT
vvsdt t

Bộ khoa học công nghệ Bộ y tế
Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng
1 Yersin, Hà Nội

báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài
nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên
phát ở quy mô phòng thí nghiệm
m số : ĐTĐL-2006/02G
GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN


đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nớc ĐTĐL-2006/02G
nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ
tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
Cố vấn khoa học :
GS.TSKH.Hoàng Thủy Nguyên

Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân
Các cán bộ tham gia
TS.Nguyễn Tuyết Nga
Thạc sỹ Đinh Thúy Vân
KS.Trịnh Tuấn Việt
CNSH.Nguyễn Kim Dung
Thạc sỹ Đoàn Văn Lu
TS.Đỗ Thủy Ngân
Thạc sỹ Nguyễn Thu Hằng
CNSH.Nguyễn Hoàng Mai
Thạc sỹ Nguyễn Bích Thủy
TS.Nguyễn Quế Anh
TS.Lê Quỳnh Mai
Thạc sỹ Nguyễn Lê Khánh Hằng
Cơ quan thực hiện :
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng các chữ viết tắt
ADN Desoxyribonucleic acid
(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)

MDHQ Miễn dịch huỳnh quang
MEM Minimum Essential Medium
Môi trờng cần thiết tối thiểu
ml mililit
àg mcg
MSV Master seed virus
(Chủng gốc giống)
M.tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
Trực khuẩn Lao
nm nanomet
NMWL Nominal Molecular Weight Limit
( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử )
OD Optical Density
Mật độ quang học
PBS Phosphat Buffer Saline
pfu Plaque Forming Unit
(Đơn vị tạo đám hoại tử)
PMKc Primary Monkey Kidney cells
QC Quality Control
Kiểm tra chất lợng
RNP Ribonucleoprotein
RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction
(phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngợc)
rpm round per minute
(Vòng/phút)
RV Realase Virus
Virut giải phóng
rg Reverse genetics
Di truyền ngợc
SIV Simian Immunodefficiency Virus

1.3. Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa 4
1.4. Sự tái tổ hợp của virút Cúm 8
1.5. Sự phát triển của

virút trên tế bào
9
1.6. Sinh bệnh học
9
1.7. Chẩn đoán

virút Cúm
10
1.8. Đặc điểm dịch tễ học
10
1.9. Kỹ thuật di truyền ngợc
13
1.10. Dự phòng 15
1.11. Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm 19

Phần

2: vật liệu và phơng pháp 21
2.1. Vật liệu
21
2.1.1 Tế bào
21
2.1.2. Virút 21
2.1.3 Kháng nguyên chuẩn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22
2.1.4. ADN plasmit
22

Vero
35

2.2.14. Phơng pháp thích ứng chủng rgA/H5N1 trên tế bào Vero
35
Phần 3: Kết quả 35
3.1. Thiết lập hệ chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin Cúm rgA/ H5N1
với đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo quy định
36
3.2. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin Cúm rgA/H5N1 trên
tế bào PMKc
43
3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm vắc xin Cúm ở quy mô phòng thí
nghiệm 48
3.4. Kiểm tra chất lợng và đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin Cúm
rgA/H5N1 trên động vật thực nghiệm
50
3.5. Kết quả nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 trên dòng tế bào
PMKc, Vero và rgA/H5N1 trên Vero
59
3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin cúm A/H5N1 về các mặt
64
KÕt luËn 70

KiÕn nghÞ 72

Tµi liÖu tham kh¶o
73
12
Kết quả hiệu giá kháng thể HI của khỉ sau khi tiêm 50
Bảng
13
Tơng quan giữa nồng độ huyết thanh khỉ và hàm lợng HA trong
vắcxin Cúm bằng thử nghiệm SRID
51
Bảng
14
Hàm lợng HA trong các loạt vắcxin đợc định lợng theo phơng pháp
SRID
52
Bảng
15
Kết quả các thử nghiệm kiểm tra về mặt sinh học 53
Bảng
16
Kết quả thử nghiệm hóa lý của các loạt vắcxin 54
Bảng
17
Kết quả kiểm tra tính gây miễn dịch trên gà 56
Bảng
18
Kết quả thử nghiệm công hiệu (ED50) trên chuột 56
Bảng
19
Kết quả hiệu giá HI sau khi gây miễn dịch trên khỉ 56
Bảng
20
Kết quả hiệu giá HI sau khi tiêm cho khỉ các liều khác nhau 58

42
Hình 7 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng
vắcxin rgA/H5N1
42
Hình 8 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng
vắcxin rgA/H5N1
43
Hình 9 Kết quả HA và OD280nm của các phân đoạn sau khi siêu ly
tâm
47
Hình 10
Hình ảnh SRID sử dụng 1,2àl huyết thanh khỉ /ml agarose định
lợng HA trong vắcxin Cúm
51
Hình 11 Hình ảnh SRID định lợng HA trong vắcxin Cúm H5N1 55
Hình 12 Hình ảnh tế bào PMKc và Vero sau khi gây nhiễm chủng
NIBRG-14 sau 48h
60
Hình 13 Kết quả PCR nhận dạng NIBRG -14 sau khi cấy truyền 62
H×nh 14 ChØ sè pH trong 15 lo¹t v¾c xin Cóm 66
H×nh 15 Hµm l−îng Protein toµn phÇn trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67
H×nh 16 Hµm l−îng Formaldehyt (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67
H×nh 17 Hµm l−îng Thimerosal (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68
H×nh 18 hµm l−îng Al+++ (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68

Bài tóm tắt
Đề tài:
Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm
A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
1. Mục tiêu chính của đề tài:

3.2. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên
tế bào PMKc
Đã xây dựng đợc quy trình sản xuất đảm bảo chất lợng, ổn định với
các thông số kỹ thuật phù hợp trong quy mô phòng thí nghiệm.
Quy trình sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 quy mô phòng thí nghiệm

Chủng gốc giống

Chủng sản xuất v
ắ
cxin

Gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát 1 lớp

Nuôi cấy 3 ngày, 37
o
C 1
o
C


Gặt -70 1
o
C (đông tan 3 lần)

Ly tâm 5000 rpm, 30 phút, 4
o
C

Nớc nổi (RV)

Các kết quả kiểm tra hóa lý của vắcxin xuất xởng cho thấy đều đạt yêu
cầu về các mặt pH, formaldehyt, thimerosal và nhôm. Từ loạt 010506
trở đi, với quy trình công nghệ ổn định và pha vắcxin dựa vào hàm
lợng HA theo thử nghiệm SRID, hàm lợng protein toàn phần
<50àg/ml đối với các loạt vắcxin có hàm lợng HA là 15àg/ml. Để
đánh giá an toàn chung của vắcxin dự tuyển, mỗi loạt đợc kiểm tra
trên chuột lang, chuột nhắt trắng và thỏ giống nh các vắcxin thông
thờng khác. Kết quả cho thấy tất cả các loạt vắcxin đều đạt yêu cầu
theo tiêu chuẩn quốc gia và của TCYTTG về an toàn chung. Để đánh
giá tính miễn dịch của vắcxin dự tuyển, vắcxin của mỗi loạt đợc tiêm
cho 5 con gà. Các kết quả HI cho thấy liều tiêm hiệu quả cho đáp ứng
miễn dịch ở 50% số gà đợc tiêm dao động từ 8,0 9,66
à
g và ở chuột
nhắt trắng là 5,37 10,0
à
g. Từ loạt 010506 trở đi, do kết quả ổn định
của quy trình sản xuất và áp dụng thử nghiệm SRID để pha vắcxin cùng
một hàm lợng 15
à
g /ml nên kết quả công hiệu rất cao (ED501,1
à
g).
Thêm vào đó, các loạt vắcxin 010305 và 030305 đã đợc xác định khả
năng gây miễn dịch trên khỉ. Sau 3 mũi tiêm, mỗi mũi cách nhau 1
tháng, hiệu giá HI của nhóm tiêm vắcxin là 1:32 1:128 so với nhóm
đối chứng âm.
Kết quả tiêm liều khác nhau trên khỉ cho thấy tại thời điểm 28 ngày
sau khi tiêm mũi 2 tất cả khỉ có đáp ứng miễn dịch > 1:40 (1:40-1:320),
đạt yêu cầu có kháng thể bảo vệ. Liều tiêm thấp nhất (7,5àg/0,5ml)

Trên chuột lang: Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thờng
trong thời gian theo dõi.
o Trên chuột nhắt: Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thờng
trong thời gian theo dõi.
* Chất gây sốt: Tổng nhiệt độ không tăng quá 13/3 thỏ
* Công hiệu (bán thành phẩm): HA 15
à
g/ml
4. Kết luận
1. Xây dựng đợc quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm
A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở qui mô phòng thí nghiệm
đảm bảo tính ổn định và cho hiệu suất cao.
2. Các loạt vắcxin Cúm A/H5N1 sản xuất quy mô phòng thí nghiệm
đã chứng minh đợc tính an toàn và hiệu quả gây miễn dịch trên
thử nghiệm tiền lâm sàng. Thử nghiệm tiêm các liều khác nhau
trên khỉ cho thấy đáp ứng miễn dịch đạt yêu cầu sau 2 mũi tiêm
với liều tiêm từ 7,5
à
g/ml trở lên với hiệu giá HAI 1/40.
5. Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất thành công vắc xin
Cúm A/H5N1 trên tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm. Đây là một thành
công có ý nghĩa to lớn đối với cả trong và ngoài nớc. Vắcxin Cúm
A/H5N1 thử nghiệm thành công trên thực địa lâm sàng sẽ đem lại khả
năng phòng chống đại dịch nếu xẩy ra. 1
Đặt vấn đề
Dịch Cúm gia cầm độc lực cao týp A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng

và tỷ lệ chết.

2
Ngay sau khi virút cúm A/ H5N1 đợc phân lập ở các bệnh nhân tại Việt
Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển vắcxin cúm A/H5N1 tại
Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH), Viện Vệ Sinh Dịch Tễ
TW (NIHE), Hà Nội. Kỹ thuật di truyền ngợc đã đợc ứng dụng để tạo
chủng cúm A/H5N1 giảm độc lực dùng cho sản xuất vắcxin từ chủng virút
H5N1 có độc tính cao (A/Vietnam/1194/2004) với sự giúp đỡ và hợp tác của
Khoa Virút- Viện Y khoa- Đại học Tokyo- Nhật Bản, dới sự chỉ đạo của
giáo s Yoshihiro Kawaoka.
Nghiên cứu này đợc tiến hành với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên tế
bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
2. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin sản xuất
đợc trên động vật thực nghiệm.

3
Phần 1
Tổng quan
1.1. Đặc điểm chung của virút cúm
Các virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ
gen dạng sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lợt mã hoá cho các protein
PA, PB1, PB2, NS, M, NP, HA, NA của virút (cúm A, B). Họ
Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, và
Thogovirus. Virút Cúm B và C thờng chỉ gây nhiễm cho ngời trong khi
phần lớn virút Cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây
nhiễm cho ngời và các động vật khác nh lợn, ngựa. Virút Cúm A, B và C
khác nhau về tính kháng nguyên của nucleocapsit (NP) và protein Matrix
(M). Trong đó virút cúm A lại đợc chia thành các phân týp dựa theo cấu

nhau và chứa 8 đoạn gen của ARN đơn [5].
Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN. NP là protein tiểu đơn vị nổi
trội của nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu
đơn vị NP. Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc
ARN bao gồm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30
bản sao trong một virion [6,7]. Các polymeraza protein chịu trách nhiệm gắn
mũ, endonucleaza, tổng hợp ARN, polyadenyl hóa [6, 7, 8, 9, 10].
Protein NS
2
là protein thứ hai do đoạn ARN 8 mã hóa, có khoảng 130-
200 phân tử trong 1 virion và tạo thành phức hợp với protein M1 [11,12] là
mối liên kết cần thiết trong chu trình sống của virỳt để giải phóng phức hợp
RNP từ nhân [13].

1.3. Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của virút Cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi virút Cúm C có
7 đoạn gen (không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của virút Cúm đã đợc tìm
hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN virút trên gen polyacrylamit
[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. Cấu trúc gen của virút Cúm nh sau: Đoạn gen 1
mã hóa cho PB2, đoạn 2 cho PB1, đoạn 3 cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5
cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2.
Trình tự nucleotit của ARN virút Cúm PR8/34 và rất nhiều phân týp khác đã
đợc công bố từ năm 1982 [21]. Virút Cúm PR8/34 có 13.588 nucleotit.

5
Bảng 1. Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa
(Trích dẫn từ Fields Virology, Ed. David M. Knipe et al, Volume 1, Fourth
edition, 2001, Lippincott William &Wilkins)
Đoạn gen Chiều dài
(nucleotit)

20-60
-
8 890 NS1
NS2
230
121
26 815
14 216
-
130-200

Đoạn ARN đơn của virút Cúm C mã hóa cho protein liên kết
haemaglutinin-esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor),
hoạt động hòa màng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở virút
Cúm A và B những hoạt tính này do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều
dài của các đoạn gen và các protein mã hóa đợc liệt kê trong bảng 1. Đoạn
gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5
và 9-12 nucleotit tại đầu 3 có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác
và giống nhau ở cả 3 loại virút Cúm A, B và C [22, 23, 24].
Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza
PB1, PB2 và PA của virút A [25] và virút Cúm B, C [26]. Đoạn gen 1 và 2
đều dài 2.341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1
757 axit amin. Đoạn gen 3 dài 2.233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716
axit amin.
NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành
RNP. NP còn là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút Cúm A, B
và C. NP đợc đoạn ARN 5 dài 1.565 nucleotit mã hóa [27]. NP chứa 498
axit amin và có trọng lợng phân tử 56.101 dalton. NP của virút Cúm B chứa
560 axit amin và tơng đồng 47% so với virút Cúm A trong khi NP của virút
Cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tơng đồng với virút Cúm A và B

dalton). Qúa trình phân tách là điều kiện quyết định để virút có khả năng
gây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [29].
HA chính là đoạn gen đầu tiên của virút Cúm đợc xác định trình tự [30].
HA
1
có từ 319 đến 326 axit amin và HA
2
có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy
thuộc vào các phân týp HA, số lợng các axit amin bị phân tách giữa HA
1
và
HA
2
là 1 đến 6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion virút Cúm
hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ,
vùng transmembrane kỵ nớc kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy
nhiên, xử lý virút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng
nguyên và cấu trúc 3 chiều, có khả năng hòa tan trong nớc và chứa toàn bộ
HA
1
cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA
2
[31,
32]. Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân
tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân týp (Tyr -98, Trp -
153, His -183, Glu 190, Leu 194) [33, 34, 35]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ
thể khác nhau giữa khí quản ngời ( 2, 6), hệ tiêu hóa gia cầm ( 2, 3) và
khí quản lợn ( 2, 3 và 2, 6), số lợng các phân tử HA có thể chuyển từ
loài này sang loài khác có thể bị giới hạn [36]. Sự phân tách HA
o

virút tấn công tế bào biểu mô đích. Đoạn gen ARN 6 của A/PR/8/34 đoạn
gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin.
Đoạn ARN thứ bẩy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027
nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lợng phân tử 27.801
dalton [50, 51, 52]. M1 là kháng nguyên đặc hiệu týp của virút Cúm và có
tính ổn định giữa các phân týp [53]. Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi
ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này đợc chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng virút
Cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của
virút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2 liên
quan đến việc kháng amantadin [54].
Đoạn ARN 8 của virút Cúm A, B và đoạn ARN 7 của virút Cúm C mã
hóa cho 2 loại protein NS1 và NS2. NS1 protein có trọng lợng phân tử
26.000 dalton. NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của virút
Cúm. NS2 protein có trọng lợng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-
200 phân tử) và tạo thành phức hợp với M1.
8
1.4. Sự tái tổ hợp của virút Cúm
Virút Cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên
cùng týp nhng không xẩy ra giữa các týp khác nhau. Sự xuất hiện của
chủng đại dịch là hậu quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có
NA hoặc HA khác hẳn với chủng lu hành trớc đó. Trong thế kỷ 20 có sự
xuất hiện của Cúm Tây Ban Nha năm 1918-1919 có HA liên quan đến
chủng virút của lợn và phân týp H1. Virút này lu hành đến năm 1957 cho
đến khi đợc thay thế bởi phân týp H2N2 (chủng châu á). Chủng H2N2 lu
hành trong 11 năm và đợc thay thế bởi phân týp H3 mới (chủng Hồng
Kông) trong đại dịch tiếp theo năm 1968 [55]. Năm 1976 chủng H1N1 lu
hành trở lại và năm 1997-1998 đã xuất hiện chủng Cúm gia cầm độc lực H5