i
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC
ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN
NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP
Mã số: ĐTĐL.2009 G/54

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế

8784

Hà Nội – 2011

iii
CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO

BSA : Bovine Serum Albumin
CDC : Center for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng chống và
kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ)
DMEM : Dulbecco’s Modifiled Eagle Medium
FBS : Fetal bovine serum
HA : Hemagglutinin
HAU : Đơn vị kháng nguyên ngưng kết hồng cầu
HI : Ngăn ngưng kết hồng cầu
LH
3
E : Lactalbumin hydrolysate Eagle
LT : Ly tâm
MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby canine Kidney cell)
MEM : Medium Essential Medium Eagle
NA : Neuraminidase
NBCS : Newborn Caft Serum
NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control
PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction)
SPF : Trứng gà sạch (Specific pathogen free)
SRD : Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn
(Single Radial Immunodifution)
TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới

iv
Mục lục
1.3.3.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắc xin 19
1.3.3.2. Các loại tế bào sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 19
1.3.3.3. Chủng virút sử dụng trong sản xuất vắc xin 20
1.3.4. Các phương pháp tạo chủng sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên nuôi cấy tế bào 22
1.3.4.1. Phương pháp tạo dòng thuầ
n chủng từ đám hoại tử (Plaque) 22
1.3.4.2. Phương pháp tạo dòng bằng phương pháp nồng độ giới hạn (Limited dilution)
23
1.3.4.3. Phương pháp cấy truyền liên tiếp 23
1.3.5. Các phương pháp cô đặc và tinh chế virút 24
1.3.5.1. Các phương pháp cô đặc và sơ chế protein virút 24
1.3.5.2. Phương pháp tinh chế virút 26
CHƯƠNG II 30
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu trong sản xuất chủng và vắcxin 30
2.1.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nhân chủng vi rút X-179a trên trứng gà SPF 30
2.1.1.1. Nguyên vật liệu 30
2.1.1.2.Các bước tiến hành 30

v
2.1.2. Nguyên vật liệu và phương pháp thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên
nuôi cấy tế bào 31
2.1.2.1 Trên tế bào vero 31
2.1.2.2 Trên tế bào phôi gà một lớp 32
2.1.3. Nguyên vật liệu và các bước tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào vero 39
2.1.3.1. Qui trình sản xuất tế bào vero 39
2.1.3.2. Qui trình sản xuất hỗn dịch virút 39
2.1.3.3. Qui trình tinh sạch 40
2.1.3.4. Qui trình siêu lọc 40

3
trong vắc xin 94
CHƯƠNG III 96
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 96
3.1. Kết quả nhân chủng vi rút X-179A trên trứng gà SPF 96
3.2. Kết quả thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào 99
3.2.1. Kết quả thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát 99
3.2.2. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105
3.2.2.1. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105
3.2.2.2. Kết quả Sản xuất và kiểm định chủng cúm A/H1N1 giống gốc trên tế bào vero

.107
3.2.3. Kết quả thích nghi trên tế bào phôi gà một lớp 119
3.2.3.1 Môi trường cho tế bào phôi gà P1 119
3.2.3.2. Kết quả thích nghi chủng H1N1 trên tế bào phôi gà Po và P1 128
3.3. Kết quả nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 131

vi
3.3.1. Kết quả nghiên cứu nghiên cứu qui trình 131
3.3.2. Kết quả sản xuất vắc xin theo qui trình 138
3.3.2.1. Qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin 138
3.3.2.2. Sản xuất và kiểm định 10.000 liều vắc xin theo qui trình 140
3.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm (Tiền lâm sàng)
145
3.4.1. Kết quả an toàn trên chuột lang 145
3.4.2. Kết quả an toàn trên chuột nhắt 148
3.5. Kết quả an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ Macaca Mulatta 151
3.5.1. Kết qu
ả an toàn vắc xin 151
3.5.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin trên khỉ thử nghiệm 153

ế bào thận khỉ tiên phát 102
Bảng 3.11. Hiệu giá HA sau cấy truyền lần 5 trên tế bào thận khỉ tiên phát 102
Bảng 3.12.Tóm tắt kết quả thích nghi chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát 104
Bảng 3.13. Hiệu giá HA của chủng cúm A/H1N1 trên tế bào vero 105
Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu nồng độ trypsin thích hợp trên chủng D1V3 105
Bảng 3.15. Liều gây nhiễm tối ưu với chủng sản xuất 109
Bảng 3.16. Kết quả nhận dạng hỗn dị
ch virút thu được 110
Bảng 3.17. Tóm tắt kết quả sản xuất, kiểm định chủng vi rút 110
Bảng 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen HA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number 063211) 112
Bảng 3.19. So sánh trình tự axit amin của protein HA giữa 5 chủng virút với chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY063211) 114
Bảng 3.20. So sánh trình tự nucleotide của gen NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL/2010 (Accession number CY063213) 115
Bảng 3.21. So sánh trình tự axit amin của protein NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm
A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY0632 117
Bảng 3.22. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng
virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 117
B
ảng 3.23. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng
vắc xin X179 và các chủng khác (179M, 179W, HV4 và AV4) 118
Bảng 3.24. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein NA giữa chủng
virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 118
Bảng 3.25. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường 199 với 5% huyết
thanh 119
Bảng 3.26. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường 199 với huyết
thanh khác nhau trên chai 25 cm
2
120

y truyền liên tiếp 130
Bảng 3.39. Thể tích và hiệu giá vắc xin thô 131
Bảng 3.40. Kết quả nghiên cứu tinh sạch kháng nguyên 131
Bảng 3.41. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV06 132
Bảng 3.42. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV07 133
Bảng 3.43. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV08 134
Bảng 3.44. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô
đặc bằng siêu ly tâm 135
Bảng 3.45. Kết quả nghiên cứu hiệu quả bất hoạt 136
Bảng 3.46. Kết quả nghiên cứu sử dụng enzym cắt ADN tồn dư của tế bào 138
Bảng 3.47. Kết quả sản xuất loạt FV06 140
Bảng 3.48 Kết quả sản xuất loạt FV07 141
Bảng 3.49. Kết quả sản xuất loạt FV08 141
Bảng 3.50. Kết quả sản xuất loạt FV09 142
Bảng 3.51. Kết qu
ả sản xuất 4 loạt vắc xin thô 142
Bảng 3.52. Chất lượng tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin 143
Bảng 3.53. Kết quả formaldehyde trong bán thành phẩm 143
Bảng 3.54. Kết quả Protein toàn phần trong bán thành phẩm 144
Bảng 3.55. Kết quả ADN tồn dư trong bán thành phẩm 144
Bảng 3.56. Kết quả vắc xin thành phẩm 144
Bảng 3.57. Kết quả định lượng kháng nguyên và mức chuyển đổi đơn vị HA 145
Bảng 3.58. Kết quả th
ử an toàn trên chuột lang 145
Bảng 3.59. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trưởng thành 148
Bảng 3.60. Trọng lượng khỉ (kg) 151
Bảng 3.61. Trọng lượng khỉ trong quá trình thử nghiệm 152
Bảng 3.62. Triệu chứng khỉ trong quá trình thử nghiệm 153
Bảng 3.63. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 153
Bảng 3.64. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 154


x
Danh mục các hình
Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử (A) và mô
hình hạt virút (B) 4
Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào 6
Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ 8
Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-) 9
Hình 2.1. Trứng gà sạch SPF 30
Hình 2.2. Kiểm tra chất lượng trứng 30
Hình 2.3. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI 88
Hình 3.1. Hiệu giá HA gây nhiễm trên trứng tại các nồng
độ khác nhau 98
Hình 3.2. Hiệu giá HA khi gặt và sau khi đông băng 106
Hình 3.3. Hình ảnh nhân lên của virút cúm A/H1N1 trên tế bào dưới kính hiển vi điện tử 107
Hình 3.4. Hình ảnh kiểm tra hiệu giá HA của cúm A/H1N1 108
Hình 3.5. Liều gây nhiễm tối ưu 109
Hình 3.6. Chủng vi rút được bảo quản tại tủ âm sâu 111
Hình 3.7. Môi trường 199 nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 120
Hình 3.8. Môi trường MEM nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 121
Hình 3.9. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà mộ
t lớp 123
Hình 3.10. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 125
Hình 3.11. Tỷ lệ tách tế bào sử dụng các loại môi trường với huyết thanh bê bào thai 125
Hình 3.12. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường M199 126
Hình 3.13. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường MEM 127
Hình 3.14. So sánh hiệu giá HA với các màng lọc khác nhau 132
Hình 3.15. Hiệu suất cô đặc loạt FV06 tại các mức độ cô đặc khác nhau 133
Hình 3.16. Hiệu suất cô đặc loạt FV07 tại các mức độ cô đặc khác nhau 134
Hình 3.17. Hi

Hình 3.41. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3
với nồng độ 900µg/liều 161
Hình 3.42. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 162
Hình 3.43. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 163
Hình 3.44. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 164
Hình 3.45. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều 165
Hình 3.46. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 166
Hình 3.47. Hiệu giá kháng thể
trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 167
Hình 3.48. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 168
Hình 3.49. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 169
Hình 3.50. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau
và không có Al(OH)3 169 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch cúm luôn là mối quan tâm hàng đầu của nhân loại. Trong lịch sử đã ghi
nhận nhiều vụ đại dịch cúm xảy ra với số người thiệt mạng lên đến hàng chục triệu
người. Tác nhân gây bệnh của mỗi vụ dịch là khác nhau, như dịch cúm Tây Ban Nha
1918-1919 do H1N1, cúm Hồng Kông 1968-1969 do H3N2 v.v. Từ năm 1997, dịch
cúm A/H5N1 xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và có tỷ lệ tử vong cao.
Tháng 4 năm 2009, dịch cúm A/H1N1 xuất hiện
đầu tiên ở Mehicô. Sau đó đã lan
nhanh ra toàn thế giới trong một thời gian ngắn. Đây là một chủng H1N1 mới do sự
tái tổ hợp từ virút cúm lợn, cúm gia cầm và cúm người tạo thành. Ngày 11 tháng 6
năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới đã tuyên bố dịch ở cấp độ cảnh báo cao nhất, cấp độ

i giá cao để có được vắc xin. Việt Nam chúng ta không
nhận được sự trợ giúp nào về vắc xin. Chúng ta cũng chưa sản xuất được vắc xin cúm,
kể cả cúm thông thường. Trước tình hình đó, Ban chỉ đạo quốc gia đã huy động toàn
bộ các nhà sản xuất vắc xin trong nước tập trung lực lượng để nghiên cứu tự sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1. Mỗi đơn vị với thế mạnh của mình sẽ nghiên c
ứu nhằm nhanh
chóng tạo ra được vắc xin. POLYVAC được giao nhiệm vụ “Nghiên cứu sản xuất
vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO và tế bào phôi gà một lớp”. Với mục tiêu
là “Sản xuất được vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO hoặc tế bào phôi gà
một lớp”.
Nội dung cần đạt được:
- Nhân chủng virút X-179a trên trứng gà SPF
- Thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào
- Sản xuất vắc xin cúm A/H1N1
-
Đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vắc xin trên khỉ
3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Virút cúm A/ H1N1
1.1.1. Phân loại
Virút cúm H1N1 thuộc type A chi Influenza virút thuộc họ Orthomyxoviridae bắt
nguồn từ hai từ gốc Hy Lạp “Orthos” là “trực tiếp” “myxo” là “tuyến”, bao gồm các
virút tấn công trực tiếp vào tuyến đường hô hấp. Có 5 nhóm (týp) virút được xếp vào
họ Orthomyxoviridae, gồm: Nhóm virút cúm A (týp A), nhóm virút cúm B (týp B),
nhóm virút cúm C (týp C), nhóm virút Isa và nhóm virút Thogoto. Sự phân nhóm virút
dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên Nucleoprotein (Kháng nguyên NP). Ngoài
ra, dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên M (Matrix protein) người ta cũng có thể

ARN) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa); phân đoạn 4 mã hoá cho
hemagglutin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế bào, gây ngưng kết hồng cầu)
(63 kDa khi chưa được glycosyl hoá và 77 kDa nếu được glycosyl hoá); phân đoạn 5
mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein muộn đóng vai trò cấu trúc dưới đơn vị
nucleocapsid) (56 kDa); phân đoạn 6 mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân
đoạn 7 mã hoá cho protein đệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và
M2 (11 kDa); phân đoạn 8 mã hoá cho protein không cấ
u trúc (NS) (non - structural
protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14 kDa).
ARN và protein của virút sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung quanh một trục tạo
nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu (đường kính 89 - 120 nm) hoặc hình sợi kéo dài
Kênh dẫn truyền ion
Vỏ lipid

A B

5
(tới vài µm) của virion. Một hạt virion có trọng lượng phân tử khoảng 250 kilo Dalton.
Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid
kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu
trúc của virút. Lớp vỏ ngoài của virút còn có các glycoprotein (protein đã được
glycosyl hoá). Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã được
biệt hoá để gắn protein màng của virút vào, gồm: protein M2 đâm xuyên và nhô ra
khỏi vỏ
ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA).
Virút cúm A được chia thành các phân typ (subtype), phân biệt nhau bởi các
kháng nguyên bề mặt hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Có 16 phân typ
HA và 9 phân typ NA đã được xác định [3]. Có tất cả 9 biến thể gen NA (N1Æ N9)
đã được phân lập từ hạt virút cúm A. Tuy nhiên, chỉ có type N1 và N2 là được phân
lập từ chủng virút gây bệnh cho người. Năm 1983, nhờ kỹ thuật X quang tinh thể, các

virút bằng việc gắn lên các thụ thể axit neuraminic trên bề mặt tế bào vật chủ. Sau khi
xâm nhập vào tế bào, HA khởi đầu cho quá trình dung hợp để giải phóng phức hợp
RNP vào bào tương. Sự phân cắt HA nhờ enzym phân cắt protein là một quá trình
quan trọng quyết đị
nh độc lực của virút. Kháng nguyên HA tạo ra đáp ứng miễn dịch
sinh kháng thể HI, đồng thời cũng là kháng thể trung hòa virút.
- Kháng nguyên NA: Là glycoprotein quan trọng thứ hai nằm trên bề mặt của hạt
virút. NA vừa có tính chất kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. NA cắt các thụ thể
gắn HA trên các phân tử mucin của tế bào biểu mô, tạo điều kiện cho virút nhanh
chóng lan tỏa ra khắp các tế bào đường hô hấp của vật chủ nhiễm virút. Ngoài ra, hoạt
tính enzym c
ủa NA còn giúp giải phóng các hạt virút mới tổng hợp ra khỏi tế vào vật
chủ (hình 1.2).

Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút
ra khỏi tế bào
Sự thay đổi kháng nguyên HA và NA của virút cúm tạo điều kiện cho sự lưu
hành của chúng trong quần thể người và không thể dự báo được sự thay đổi đó. Sự
thay đổi từ từ của kháng nguyên được gọi là sự trôi kháng nguyên - “antigennic

7
drift”. Đó là kết quả của tích lũy dần các đột biến điểm tại các gen mã hoá cho HA và
NA. Sự thay đổi các axit amin liên tiếp trong vùng gen quan trọng được tích lũy từ
năm này qua năm khác. Đối với virút cúm A, những kết quả từ áp lực chọn lọc của sự
tăng cấp độ miễn dịch trong quần thể người là nguyên nhân của sự trôi kháng nguyên
và dẫn tới sự biến đổi đáng kể v
ề kháng nguyên theo chu kỳ từ 2 đến 3 năm. Axit
amin thay đổi tại protein HA và NA là khoảng 0,5 đến 1% trong 1 năm. Sự trôi kháng
nguyên tạo ra chủng virút gây dịch thường có đột biến tại hai hoặc nhiều vùng của
kháng nguyên HA.

sung [cARN (+)] nhờ enzym ARN - polymeraza phụ thuộc ARN. Chính các cARN
(+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu
di truyền của virút. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã t
ạo ra các mARN
(+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác
nhau xảy ra ở tế bào chất. Một số protein được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi
ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó, được vận chuyển ra tế
bào chất. Tại đây, một số các protein khác được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy
Golgi, tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việ
c nảy chồi của virút.
Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA
phân cắt axit sialic giải phóng virút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây
nhiễm mới (Hình 1.3).

Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ

9

Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-)
Sau khi xâm nhập và cởi vỏ một phần (bước 1), RNA tiến hành phiên mã nhờ
RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) do virút mang theo để tạo mRNA (bước 2)
cho tổng hợp protein cấu trúc và không cấu trúc (bước 3). Enzyme RdRp tiến hành sao
chép RNA thông qua bước trung gian là tạo RNA chuỗi dương (đối genome) có chiều
dài đủ (bước 4 và 5). Đối genome được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA
genome (bước 5). Một phần RNA genome được dùng để phiên mã mạnh, tạo ra
mRNA cần cho t
ổng hợp protein (bước 6 và 7), một phần để lắp ráp với protein để tạo
virút mới (bước 8).
1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học
Virút cúm tương đối mẫn cảm với nhiệt độ. Khả năng lây nhiễm của virút bị

kỹ thuật di truyền. Một đặc tính nữa của phân tử HA quyết định độc tính của virút là
tác độ
ng lên các gốc không chứa oxy, hoạt hóa yếu tố nhân tăng cường chuỗi nhẹ kapa
của các tế bào lympho B hoạt hóa (NF-κB), kích hoạt các gen tổng hợp yếu tố hoại tử
mô α (TNFα), interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2) và interleukin-6 (IL-6) dẫn
đến sốt cao, phá hủy tế bào, suy kiệt và sốc. Độc tính của virút còn phụ thuộc vào hoạt
tính enzym neuraminidase (NA) của virút. Nhờ có hoạt tính NA, mối liên kết giữa axit
sialic trên bề mặt tế bào và HA của virút được phá vỡ và virút sẽ đượ
c giải phóng ra
khỏi tế bào để xâm nhiễm sang tế bào khác.
1.1.8. Tính chất nuôi cấy
Virút cúm có khả năng thích ứng trên tế bào thận khỉ tiên phát (PMK), thận
chó thường trực (Madin-Darby Canine kidney cells, MDCK), tế bào thận khỉ Rhesus
thường trực (LLCM-K2), tế bào thận khỉ xanh châu phi (Vero), tế bào phôi gà, Virút
có mặt trong tế bào có thể được quan sát dựa trên sự hay đổi hình dạng tế bào (sự huỷ
hoại tế bào-CPE). Tuy nhiên, nhiều chủng virút cúm không tạo CPE, trong trường hợp
này, phản ứng h
ấp phụ hồng cầu chuột lang trên bề mặt tế bào thường được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của virút trong tế bào. Phôi gà 9-10 ngày tuổi là tốt nhất cho
phân lập virút cúm A và B. Tuy nhiên, đối với virút cúm C thì nên dùng phôi 7-8 ngày
tuổi. Khi phân lập virút nên cấy vào cả khoang niệu và khoang ối. Khi virút đã thích
ứng thì chỉ cần cấy vào khoang niệu. Virút có mặt trong dịch nuôi cấy tế bào, trong
dịch ối và dịch niệu được phát hiện bằng phản ứ
ng ngưng kết hồng cầu (HA). Có thể

11
sử dụng hồng cầu gà, hồng cầu chuột lang hoặc hồng cầu người nhóm máu O để tiến
hành phản ứng HA. Tuy nhiên, virút cúm C không ngưng kết hồng cầu chuột lang.
1.1.9. Khả năng gây bệnh và đặc điểm lâm sàng
1.1.9.1. Khả năng gây bệnh (đáp ứng miễn dịch)


12
Trong quá trình bị nhiễm virút cúm, kháng thể kháng glycoprotein HA và NA
đóng vai trò rất quan trọng: (1) Kháng thể hemagglutinin (HA) ngăn cản virút xâm
nhập vào tế bào chủ; (2) Kháng thể neuraminidase (NA) ngăn cản sự giải phóng của
virút ra khỏi tế bào chủ. Nhiều nghiên cứu xác định, trong nhiễm trùng tiên phát, các
kháng thể đặc hiệu với hemagglutinin như IgA, IgM và IgG xuất hiện ở dịch mũi được
tiết ra một cách tích cực. Kháng thể IgA có vai trò quan trọng trong ngăn chặn sự
nhiễm virút, hoạt động củ
a nó diễn ra tại bề mặt màng nhày của bộ máy hô hấp. Trong
nhiễm virút cấp tính, kháng thể IgG hạn chế sự nhân lên của virút và interferon cũng
giúp cho sự hồi phục có hiệu quả. Ngoài ra, những sự ức chế không đặc hiệu đối virút
cúm cũng được biết tới, đó không phải là kháng thể nhưng có vai trò trong việc ngăn
chặn sự nhiễm bệnh cũng như hồi phục sau nhiễm virút, tuy nhiên, vai trò của nó cũng
chưa được nghiên cứu rõ.
1.1.9.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H1N1
Virút cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp thông qua cơ chế
trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào được trong tế bào biểu mô đường hô hấp,
virút nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào để chui ra và xâm nhập vào các tế
bào lành khác [6]. Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virút cúm bị các yếu tố miễn dịch
không đặc hiệu của cơ thể như d
ịch mũi họng, dịch phế nang và IgA chống lại. Khi
virút cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm xuống cơ quan hô hấp
dưới, đó là phổi. Tại đây chúng nhân lên rất nhanh và phá huỷ các tế bào.
Triệu chứng lâm sàng: thời gian ủ bệnh là 1-4 ngày, các triệu chứng bắt đầu
xuất hiện một ngày sau khi virút phá vỡ tế bào chui ra. Bệnh nhân cúm A có hiện
tượng sốt liên tục trên 38
0
C, đau đầu, đau cơ, ho, đau họng, bệnh nhân khó thở (nhịp
thở có lúc chỉ còn 30-40 lần/phút), độ bão hoà oxy giảm, tụt huyết áp, bạch cầu giảm.

t hoạt
Các vắc xin cúm mùa thường ở dạng vắc xin đa giá, gồm chủng A/H1N1,
A/H3N2 và 1 chủng cúm B mỗi liều chứa 15µg kháng nguyên mỗi loại. Hiện nay có 3
loạt vắc xin chủ yếu: vắc xin cúm toàn phần, tiểu phần và vắc xin kháng nguyên bề
mặt.
Vắc xin cúm toàn phần: Chế phẩm vắc xin cúm toàn phần trong nhiều trường
hợp chỉ qua một bước tinh sạch bằng siêu ly tâm trước khi được bất hoạt. Vắc xin này
chiếm chưa tới 1/3 tổng số vắc xin cúm được sản xuất hiện nay.
Vắc xin cúm tiểu phần: Phần lớn các vắc xin hiện nay là vắc xin tiểu phần,
được sản xuất từ virút tinh sạch kết hợp với xử lý hóa chất. Quá trình phân mảnh tách
rời virút cho phép các kháng nguyên được tinh sạch từng phần, loại bỏ một số thành

14
phần của virút tạo vắc xin ít gây dị ứng. Quá trình bất hoạt ít nghiêm ngặt so với vắc
xin toàn phần do quá trình phân tách cũng được xem như đã bất hoạt một phần.
Vắc xin cúm kháng nguyên bề mặt: Được sản xuất như vắc xin tiểu phần nhưng
quá trình tinh sạch nghiêm ngặt hơn, Do đó, vắc xin chỉ chứa 2 kháng nguyên HA và
NA. Các kháng nguyên tinh sạch này sau đó được hoàn nguyên với lớp đôi lipit tổng
hợp và hình thành các thể virút. các thể
virút vắc xin cúm được cấp phép tại châu Âu.
1.2.1.2. Vắc xin cúm nhược độc
Vắc xin cúm dạng này đước sử dụng ở Liên xô cũ trước đây, nhưng việc sử
dụng đã trở nên giảm do vấn đề kinh tế và sụp đổ của Liên xô cũ. Gần đây chúng lại
được phát triển trở lại ở Mỹ nhằm thay thế vắc xin cúm bất hoạt do chúng có những
ưu điểm: Không yêu cầ
u nghiêm ngặt quá trình sau thu hoạch; năng xuất cao gấp 10-
15 lần so với vắc xin bất hoạt; không cần tiêm trích mà chỉ cần qua đường nhỏ mũi;
kích thích đáp ứng miễn dịch rộng bao gồm đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng
qua trung gian tế bào và hệ thống; Có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch chỉ sau
01 liều sử dụng. Vắc xin tái tổ hợp này được tạo ra b