VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC CHỮA BỆNH CÚM
DO VIRUT H5N1 GÂY RA TỪ NGUỒN NGUYÊN LIỆU
TRONG NƯỚC
MÃ SỐ: ĐTĐL-2006-O1/06

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN QUYẾT CHIẾN
của Việt Nam (Chiết xuất và tinh chế Axit shikimic, Viện Hóa học thực hiện).
 Đề tài nhánh 3: Nghiên cứu các qui trình tổng hợp Tamiflu từ axit shikimic (Tổng
hợp Oseltamivir, Viện Hóa học thực hiện)
 Đề tài nhánh 4: Nghiên cứu sử dụng hoạt chất oseltamivir photphat làm thuốc
chữa b
ệnh cúm do virut H5N1 gây ra (Nghiên cứu dược lý và bào chế thuốc,
Trường Đại học Dược Hà Nội thực hiện).

1.2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu:
1.2.1. Nguyên liệu:
 Quả hồi khô, mua trên thị trường hoặc hồi tươi tự thu mua tại nơi sản xuất.

2
 Axit shikimic tự chiết xuất từ quả hồi của Việt Nam.
 Các hoá chất và dung môi dùng cho các quá trình chiết xuất và tổng hợp mua của
các hãng phương tây, Nhật Bản hoặc Trung Quốc.
1.2.2. Phương pháp nghiên cứu:
 Các phương pháp về Sinh học và Sinh thái, Tài nguyên Sinh vật học, được thực
hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
 Các phương pháp chiết tách, tinh chế, xác đị
nh cấu trúc và phân tích các hợp chất
hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Các phương pháp dùng để
phân tích cấu trúc như phổ MS, LC/MS, IR và NMR (một chiều và hai chiều)
được thực hiện tại Viện Hoá học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ được dựa theo các sách về hữu cơ cơ bản và
các công bố trong tư liệu, được thực hiệ
n tại Viện Hoá học.
 Các phương pháp nghiên cứu về y dược được sử dụng là những phương pháp quy

ã xây dựng được quy trình công nghệ chiết xuất và tinh chế axit shikimic từ quả
hồi của Việt Nam trên quy mô từ 35, 100 và 200 kg hồi khô/mẻ. Hiệu suất axit
shikimic thu được sau khi tinh chế đạt từ 5 – 7% tính theo trọng lượng hồi khô.
Độ tinh khiết đạt >90%, đáp ứng đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu để tổng hợp hoạt
chất oseltamivir. Áp dụng quy trình công nghệ này, đã tiến hành sản xuất được 50
kg axit shikimic từ 1 tấn quả hồi khô đạt hàm l
ượng >90% và hiệu suất so với
trọng lượng quả hồi khô đạt từ 5 - 6%.
1.3.3. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 3 "Tổng hợp Oseltamivir":
 Đi từ axit shikimic chiết xuất được từ quả hồi của Việt Nam, đã xây dựng được
quy trình tổng hợp hoạt chất oseltamivir photphat qui mô 100 g / mẻ ổn định và
phù hợp với điều kiện Việt Nam. Qui trình này ứng dụng các ti
ến bộ mới được
công bố, không sử dụng hóa học azit và gồm hai giai đoạn: giai đoạn 1 gồm 6
bước phản ứng, cho hiệu suất 65%, tương đương với kết quả công bố trên tư liệu
quốc tế (63-65%); giai đoạn 2 gồm 7 bước phản ứng, cho hiệu suất 40%, cao hơn
phương pháp công nghiệp của hãng Roche (27-29%) nhưng còn thấp hơn phương
pháp thế hệ hai của Roche (61%). Theo yêu c
ầu của chủ nhiệm đề tài nhánh 4
"Nghiên cứu dược lý và bào chế thuốc", đã được hội đồng kiểm tra định kỳ của

4
Bộ KH&CN 5/2007 thống nhất, Viện Hóa học đã ứng dụng quy trình này để tổng
hợp ra 630 gam hoạt chất oseltamivir photphat có chất lượng đảm bảo để nghiên
cứu dược lý và bào chế thuốc. Số lượng sản phẩm này cao hơn rất nhiều so với chỉ
tiêu được giao là 100 g mà không cần kinh phí bổ sung cho hóa chất là nhờ hiệu
suất của các giai đoạn phản ứng thực tế đạt được cao h
ơn so với dự kiến ban đầu.
1.3.4. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 4 "Nghiên cứu dược lý và bào
chế thuốc":

5
gian đã được gia hạn, 10-2008, là 2 tháng). Nguyên nhân khách quan là do các nội
dung chủ chốt về phần dược chỉ bắt đầu được khi có đủ lượng oseltamivir
photphat do Viện Hóa học cung cấp (vào tháng 12-2007), và lượng oseltamivir
photphat cần thiết cho các nghiên cứu phần dược cũng cao hơn nhiều so với hoạch
định ban đầu (600 g so với 100 g). Nguyên nhân chủ quan là do năng lực hoạch
định và điều hành của chủ nhiệm đề tài chưa tốt.


Trên cơ sở các kết quả đã đạt được và nhận thấy tiềm năng của cây hồi Việt Nam
trong việc cung cấp nguyên liệu axit shikimic cho sản xuất thuốc chống cúm gia
cầm Tamiflu, đề nghị các cấp quản lý của Bộ Y tế có chính sách thích hợp để
khuyến khích hỗ trợ trồng cây hồi, đồng thời thúc đẩy hợp tác với Hãng dược
phẩm Roche để tiến tới có thể sản xu
ất và xuất khẩu axit shikimic.

Các hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp: etyl shikimat, etyl 3,4-O-
propyliden-5-methanesulfonyl shikimat, và epoxit là các chất sạch, ở dạng tinh thể
bền, có thể nghiên cứu để thương mại hóa như axit shikimic.

 Cần tiếp tục nghiên cứu để bổ sung và đi sâu vào những nội dung sau:
- Xác định hàm lượng của axit shikimic trong các giống hồi khác nhau, trồng ở
các địa phương khác nhau để chọn ra giống cây thích hợp.
- Tìm phương pháp mới để thu hồi tinh dầu có hiệu quả hơn.
- Nghiên cứu độ ổn định của oseltamivir photphat và viên nang sau thời gian bảo
quản dài hơn.
- Xác đị
nh các thành phần tạp chất có trong sản phẩm oseltamivir photphat.
- Đưa qui trình axit shikimic và oseltamivir photphat vào sản xuất.


- I. fargersii Franch: phân bố ở Phanxipan (Sa Pa, Lào Cai)
- I. majus Hook. f. et Thoms. = Đại hồi, phân bố: Lào Cai (Phanxipan)
- I. pachyphyllum A.C. Smith = Hồi lá dầy, phân bố: Hà Giang (Đồng văn, Phó
Bảng)
- I. parviflorum Merr. = Hồi lá nhỏ, phân bố: chỉ gặp tại Bạch Mã (T.T. Huế) và Bà
Nà (Đà Nẵng)
- I. peninsulare A.C.Smith = Hồi bán đả
o, phân bố: Yên Bái, Kon Tum.

7
- I. petelotii A.C.Smith.= Hồi Petelot, phân bố: Lai Châu, Lào cai.
- I. simonsii Maxim. = Hồi Simons, phân bố: Lào Cai (Sa Pa)
- I. tenuifolum (Ridl.) A.C. Smith. = Hồi lá mỏng, phân bố: Nghệ An, Gia Lai, Lâm
Đồng, Khánh Hoà.
- I. ternstoeminoides A. C. Smith. = Hồi chè, phân bố: Sơn La (Sông Mã, Sốp Cộp).
- I. tsaii A. C. Smith.= Hồi Tsai, phân bố: Lào Cai (Phanxipan).
Trong số các loài Hồi hiện biết, chỉ loài Hồi trồng (I. verum) là loài có diện tích
lớn, tập trong và có giá trị cao do sản phẩm (tinh dầu, quả khô) được sử dụng rộng rãi.
Các loài còn lại chủ y
ếu được khai thác và sử dụng trong dân gian trong một số bài
thuốc dân tộc (rễ hồi núi ngâm rượu chữa bong gân, hoặc trong một vài bài thuốc trị
thương của những người học võ nghệ).
Loài hồi trồng (Illicium verum Hook. f.) là một taxon tương đối nguyên thuỷ
thuộc họ Hồi (Illiciaceae) với các đặc điểm điển hình: cây gỗ lớn hoặc trung bình, bao
hoa chưa phân hoá thành đài và tràng, tồn tại dưới dạng các m
ảnh bao hoa. Quả nhiều
lá noãn, rời, chỉ hợp ở phần gốc tạo thành quả có nhiều đại (cánh quả). Số lượng thành
phần của hoa (mảnh bao hoa, nhị, noãn) nhiều, dao động. Trong nhiều trường hợp vẫn
còn quan sát thấy các dạng tiến hoá trung gian của mảnh bao hoa và nhị.
Đặc điểm cơ bản nêu trên đã được ghi nhận từ lâu; tuy nhiên, trong bản mô tả đầu

ủa chồi non. Trường hợp này
gọi là "hồi đỏ ngọn" và năm đó hồi thường không có quả.
Mỗi năm hồi ra hoa hai lần kế tiếp nhau. Đợt hoa đầu tiên từ cuối tháng 6 đến cuối
tháng 7 gọi là hoa vụ tứ quý (chủ yếu vào cuối tháng 7). Đợt hoa thứ hai (gọi là hoa vụ
mùa) nở tiếp sau ngay lứa hoa vụ tứ quý kéo dài từ tháng 7 tới tháng 10. Thực tế vào
thời điểm giao thời r
ất khó phân biệt hoa của hai vụ.
Ngay sau khi nở hoa, vụ hoa đầu tiên tiếp tục phát triển và hình thành lứa quả thu
vào tháng 12 hoặc tháng 1 năm sau, gọi là vụ hồi Tứ quý. Lứa hoa thứ hai mặc dù hình
thành ngay sau lứa hoa thứ nhất, nhưng sau khi hoa nở các bao hoa khô đen và bọc lấy
quả non. Các quả này hầu như dừng sinh trưởng cho tới tháng 3 hoặc tháng 4 năm sau.
Lứa quả này thực sự chỉ lớn nhanh vào cuối tháng 3 hoặc đầu tháng 4 khi nhiệt
độ
không khí cao và hình thành vụ quả thu hoạch vào tháng 8-9 gọi là vụ hồi mùa.
Thông thường khích thước và trọng lượng quả hồi vụ tứ quý chỉ bằng 30-40%
quả hồi mùa và năng suất quả tứ quý thường chỉ đạt 20-30 % năng suất quả vụ mùa.
Ngoài hai vụ hoa chính, nhiều khi quan sát thấy một số cây xuất hiện hoa vào các
tháng khác, nhưng không nhiều và không đậu quả. Hiện tượng này thường gặp ở
những n
ăm nhiệt độ không khí cao. Kết quả quan sát này phù hợp với nghiên cứu
trước đây: vào năm 1906, người Pháp đã thử nghiệm trồng hồi tại trạm thí nghiệm Phú
Hộ (Phú Thọ). Tại đây với nhiệt độ không khí cao, lượng mưa trung bình năm đạt
1800 mm, cây hồi ra hoa không tập trung thành vụ và tỷ lệ đậu quả rất thấp. Tới năm

9
1938 việc trồng hồi tại Phú Hộ không tiếp tục với kết luận nhiệt độ không khí cao
không thích hợp và làm rối loạn nhịp điệu sinh trưởng của cây hồi.

2.1.3. Năng suất và chất lượng hồi của Việt Nam
Hồi của Việt Nam được trồng ở nhiều địa phương với các điều kiện khí hậu, thổ


10
Hàm lượng trans-anethole trong tinh dầu hồi ở các vùng khác nhau được xác định
dao động trong khoảng 71,00 % 98,47% (mẫu thu tại Cao Lộc, Lạng Sơn). Nhìn chung,
hầu hết các mẫu tinh dầu nghiên cứu của các tác giả đã công bố đều cho hàm lượng
trans-anethole trên 80%, nhiều mẫu đạt trên 90% và hàm lượng cis-anethole không
vượt quá 1%. Do vậy có thể khẳng định tinh dầu hồi của Việt Nam có chất lượng rất
cao.
Tuy nhiên trong quá trình nghiên cứu, cũng phát hiện các mẫu tinh dầu có hàm
lượng trans-anethol rất thấp: 54,77%. Đặc biệt tại Cao Bằng đã phát hiện mẫu hồi có
hàm lượng cis-anethole rất cao (23,98 %) (Nguyễn Văn Toàn, 2005). Đây là chất có
độc tính cao, theo tiêu chuẩn hiện nay, trong tinh dầu hồi hàm lượng cis-anethole
không được vượt quá 3%. Đáng chú ý là trong mẫu phân tích này xuất hiện methyl
chavicol với hàm lượng 16,38%. Rất có thể mẫu quả này được thu từ loài hồi hoang
dại mọc phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc (Illicium griffithii). Dù sao đây c
ũng là
hiện tượng rất cần kiểm tra thêm trong thời gian sắp tới vì liên quan tới chất lượng của
tinh dầu hồi Việt Nam.
Cây hồi là một cây công nghiệp quan trọng, cây tinh dầu có giá trị kinh tế cao của
tỉnh Lạng Sơn nói riêng và của nước ta nói chung. Cây Hồi đã được trồng ở nhiều địa
phương vùng núi Bắc bộ, trong đó nhiều nhất là tỉnh Lạng Sơn. Việc trồng Hồi di
ễn ra
chủ yếu là tự phát, bằng kinh nghiệm của người dân truyền lại cho nhau. Mặc dù nhiều
vùng có Hồi như vậy nhưng năng suất, chất lượng của các sản phẩm từ Hồi (hoa hồi-
quả hồi, tinh dầu hồi) không đồng đều dẫn đến nhiều khó khăn trong quá trình chế biến,
tiêu thụ sản phẩm.
Cây Hồi (Illicium verum) được chồng chủ yếu ở Nam Trung Quốc và m
ột số tỉnh
phía Bắc Việt Nam, trong đó đa phần là tại tỉnh Lạng Sơn. Việc điều tra diện tích,
đánh giá sản lượng và nghiên cứu chất lượng của vùng Hồi nguyên liệu là một trong

1987 là giai đoạn thị trường Hồi các nước Đông Âu bị khủng hoảng, đồng thời quan hệ
căng thẳng giữa biên giới Việt Trung, đã làm cho sản lượng Hồi của ta không xuất
khẩ
u được. Do vậy, trong thời gian này một phần diện tích rừng ở Bình Liêu (Quảng
Ninh) và ở Lạng Sơn đã bị thay thế bằng các loài cây trồng khác. Đến những năm
1990, sản phẩm Hồi lại có thị trường từ các nước Tây Âu, Nhật Bản, Singapore, đặc
biệt là sản phẩm Hồi của ta được xuất qua biên giới Việt Trung để sau đó lại tái xuất
sang các nước khác. Như đã trở thành quy lu
ật có cầu sẽ có cung, người dân vùng
Đông Bắc lại tiếp tục trồng Hồi, đồng thời thu hoạch tận dụng trên diện tích Hồi còn
lại.

2.2. Tổng quan tư liệu về "Chiết xuất và tinh chế Axit shikimic"
:
2.2.1.
VAI TRÒ CỦA AXIT SHIKIMIC TRONG SẢN XUẤT THUỐC TAMIFLU

12
Axit shikimic được tách ra lần đầu tiên từ quả của một
loài Hồi có độc tính, gọi là Hồi Nhật bản Illicium anisatum năm
1885 [16] dưới dạng tinh thể màu trắng. Thực tế, axit shikimic
có mặt ở trong rất nhiều loài cây khác nhau và thường là hợp
chất trung gian quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp của
nhiều lớp chất. Tuy nhiên, hiện nay cây hồi được quan tâm
nhiều nhất trong việc tạo ra nguồn axit shikimic bởi hàm lượng
axit này trong quả hồ
i rất cao, 5 – 10%.
Kể từ khi thuốc Tamiflu được bào chế ra cách đây gần 10 năm bởi Tập đoàn Gilead,
nhưng sau đó hãng dược phẩm Roche Holding AG mua lại bản quyền bào chế Tamiflu và
người ta đã chính thức sử dụng công nghệ sản xuất oseltamivir từ nguyên liệu đầu là axit

OH
Axit shikimic

13

Dịch nớc chứa axit shikimic
từ quá trình lên men vi sinh
Cô đặc
Cặn axit
shikimic thô
Dịch axit acetic
chứa axit shikimic
Axit shikimic
Thêm axit acetic,
đun ở 70
o
C
Làm lạnh
đến 6
o
C

Hỡnh II.1: S tinh ch axit shikimic t dch lờn men vi sinh

Ti Vit Nam cho ti khi thc hin ti ny, cha cú cụng trỡnh no cụng b v vic
phõn lp axit shikimic t qu hi. Nc ta cú ngun hi di do thun li cho vic to ra
ngun axit shikimic. Chớnh bi vy nờn vic nghiờn cu cụng ngh chit tỏch v tinh ch axit
shikimic trờn quy mụ ln l vic lm cp bỏch trong bi cnh hin nay.
Công và Trung Quốc
Dựa trên tính khẩn cấp của tình hình, tháng 10 năm 2005 Công ty dược Cipla
của Ấn Độ công bố kế hoạch sản xuất Oseltamivir mà không cần li-săng của Roche.
Thái Lan, Hàn Quốc và Đài Loan cũng hành động tương tự [26]. Tháng 12-2005
Roche cấp quyền sản xuất cho Shanghai Pharmaceuticals của Trung Quốc, tháng 3-
2006 cho Hetero của Ấn Độ.
Hiện nay tình hình có thể đã khác. Sau nhiều hoạt động mở rộ
ng sản xuất,
Roche tuyên bốt họ sản xuất tới 400 triệu liều, đủ thuốc để chữa bệnh cúm theo mùa
và cũng đủ cho các chính phủ mua dự phòng [27]. Tuy nhiên, nếu đại dịch xảy ra, sự
khan hiếm có khả năng lại tái diễn.

2.3.2. Tính chất và yêu cấu chất lượng của Oseltamivir và Oseltamivir photphat Oseltamivir là một hợp chất hữu cơ ở dạng tinh thể không mầu, có danh pháp
hoá học tiếng Anh là ethyl (3R,4R,5S)-5-amino-4-acetamido-3-(pentan-3-
yloxy)cyclohex-1-ene-1-carboxylate, có công thức phân tử là C
16
H
28
N
2
O
4
, KLPT
312.4 g/mol, CAS-No. 196618-13-0.
Oseltamivir photphat là muối 1:1 của Oseltamivir với axit photphoric, cũng ở
dạng tinh thể không mầu, có danh pháp hoá học tiếng Anh là (3R,4R,5S)-4-
acetylamino-5-amino-3- (1-ethylpropoxy)-1-cyclohexene-1-carboxylic acid ethyl ester,

O4⋅1.5H
2
O: C, 54.01; H, 8.73; N, 9.00. Found: C,
53.69; H, 8.70; N, 8.71.

Trong bài báo công bố năm 1998 [29], Rohloff và cộng sự cho biết Oseltamivir
photphat có các tính chất như sau:
Trạng thái vật lý: Kết tinh trong hỗn hợp phản ứng (EtOH tuyệt đối và axit
photphoric) cho tinh thể hình kim mầu trắng;
Đnc 203-4 °C;
[α]
D
= -39.9° (c 1, H
2
O);
IR (KBr) 3500, 1719, 1661 cm
-1
;
1
H NMR (500 MHz, D
2
O) δ 6.87 (1 H, s), 4.78 (bs, HOD), 4.34 (1 H, d, J = 8.5
Hz), 4.29-4.25 (2 H, m), 4.07 (1 H, dd, J = 8.5, 11.6 Hz), 3.63-3.54 (2 H, m),
2.97 (1 H, dd, J = 5.5, 17.1 Hz), 2.54 (1 H, m), 2.10 (3 H, s), 1.62-1.55 (3 H, m),
1.53-1.45 (1 H, m), 1.31 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 0.90 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 0.86 (3 H,
t, J = 7.3 Hz);
13
C NMR (125 MHz, D
2
O) δ 178.1, 170.3, 140.8, 130.5, 87.1, 78.0, 65.2, 55.6,

C), 6,6 (70
o
C), còn Oseltamivir photphat là chất rắn dạng tinh
thể mầu trắng. Ngoài ra không có thông số nào khác [30]. Khác với thông thường, các
hãng sản xuất Oseltamivir photphat như Roche, Cipla, Hetero và Trung Quốc không
thấy công bố kết quả phân tích sản phẩm của mình trên thông tin đại chúng qua
Internet.
Đến nay Oseltamivir photphat còn chưa có trong dược điển. Tháng 9-2007
WHO mới công bố bản dự thảo chuyên đề Oseltamivir photphat cho Dược điển Quốc
tế với các thông số và yêu cầu chất lượng như sau [31]:
Mô tả Chất bộ
t mầu trắng đến hơi xám
Công thức phân tử
C
16
H
28
N
2
O
4
⋅H
3
PO
4
(Cũng là: C
16
H
31
N

o

 Kim loại nặng: < 10 µg/g
 Tro sunphat: < 2,0 mg/g
 Nước: < 5 mg/g

2.3.3. Sự ra đời của Oseltamivir
Đại dịch cúmg năm 1918 ( cúm Tây Ban Nha) đã cướp đi ước tính từ 20 đến 40
triệu sinh mạng trên khắp thế giới; tức là nhiều hơn cả cuộc thế chiến thứ nhất trước
đó. Dịch năm 1957 ( Cúm châu Á) và năm 1958 ( cúm Hồng Kông) đỡ thiệt hại hơn,

17
song lại chung vài nét cơ bản với cúm Tây Ban Nha: thủ phạm vẫn là virus gốc gác
vốn ở loài chim, đã có sự tái tổ hợp giữa các virus đã biết của loài người và/ hay là các
virus của loài chim. Chẳng còn nghi ngờ gì nữa: những đợt bùng phát trở lại ấy báo
trước, rồi sẽ xuất hiện những dòng virus cúm mới mà loài người không hề được miễn
dịch để chống trả. Có thể rồi lại có một tr
ận đại dịch lớn. Vấn đề quan trọng là bao giờ
và rồi sẽ xử lý như thế nào.
Tên dịch cúm Năm Tử vong Loại virut cúm
Asiatic (Russian) Flu 1889-90 1 million possibly H2N2
Spanish Flu 1918-20 40 million H1N1
Asian Flu 1957-58 1 to 1.5 million H2N2
Hong Kong Flu 1968-69 0.75 to 1 million H3N2
Avian Flu 2003-2008 245 H5N1

Virus cúm H5N1 của loài chim vốn xuất xứ từ đàn gia cầm ở Hồng Kông năm
1997; tính đến tháng 9-2008 387 người đã nhiễm phải nó và tỷ lệ tử vong là 63% (Việt
Nam là 106 và 49%) [55]. Virus cô lập, gốc gác thuần túy ở loài chim, không phải một
dòng ghép, như thế không thể truyền từ người sang người . Tuy vậy vẫn dấy lên mối lo

quả lâm sàng, đã bị phản bác vì xuất hiện hiện tượng kháng thuốc và vì những tác
dụng phụ độc hại. Thêm nữa, khả năng áp dụng chỉ cho cúm A cũng là một hạn chế
nghiêm trọ
ng. Ngược lại, neuramidase là một enzym thiết yếu cho sự phiên bản của
virus trong cả ba lớp NA xúc tác cho các mẩu axit sialic ra khỏi các glycoprotein và
giải phóng virion còn đang nẩy chồi ra khỏi tế bào đã bị nhiễm, ức chế sập bẫy và tự
kết tụ. Enzym là một tetramer gồm bốn tiểu phân đơn nguyên đồng nhất; cấu trúc tinh
thể của nó cũng như cấu trúc của phức hệ của nó với axit sialic đã được gi
ải bằng tia
X. Vị trí hoạt động được bảo tồn ở mức cao qua mọi dòng virut cúm A và B, như thế
gợi ra: NA chính là cái bia cần nhằm để mà phát triển kháng sinh chống cúm phổ rộng.
Dữ liệu cấu trúc đã cho phép thiết kế hợp lý những chất ức chế tiềm năng. Hai trong số
những chất ức chế ấy đã có mặt trên thị trường, cụ thể zanamivir, GSK’s Relenza (6),
tháng bẩy 1999 và oseltamivir phosphat, Gilead’s Tamiflu (
2), trong tháng mười 1999.
Sự ra đời của oseltamivir gắn liền với các nghiên cứu bắt đầu từ cách đây 20
năm của các nhà khoa học Úc (von Itzstein và các cộng sự thuộc Đại học Monash) với
enzym NA là một trong hai glycoprotein được biểu hiện trên bề mặt của virut. Chúng
chia cắt axit sialic nằm ở đầu mút của các glycoprotein, glycolipit và oligosaccharit và
do đó là cần thiết để giải phóng và phát tán các virion mới được sinh ra từ các tế bào bị

19
nhiễm bệnh. Nó cũng trợ giúp cho quá trình vận chuyển virut qua lớp chất nhầy của
đường hô hấp. Von Itzstein và các cộng sự đã nhận thấy NA là một đích phân tử có
nhiều triển vọng để nghiên cứu phát triển thuốc. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu cấu
trúc của NA đồng kết tinh với axit sialic (5) bằng nhiễu xạ Rơn-ghen, các nhà khoa
học đã thiết kế và sau đó tổng hợ
p ra một loạt các hợp chất tương tự của axit sialic có
khả năng ức chế hoạt động của enzym này. Trong số đó chất có ký hiệu GG167 sau
này đã trở thành zanamivir (6) (còn gọi là relenza), thuốc chống cúm đầu tiên có tác

năm 1885 từ quả của một loài hồi có độc tính, gọi là hồi Nhật bản Illicium anisatum.
Từ quả hồi của Việt Nam Illicium verum Hook. f. (họ hồi, Illiciaceae), gần đây axit
shikimic đã được chiết tách và phân lập với hiệu suất 7 % [32].

20
Axít shikimic là nguyên liệu tự nhiên lý tưởng để tổng hợp oseltamivir do phân
tử của nó đã có sẵn các nhóm chức cơ bản cần thiết với các cấu hình không gian phù
hợp, nhất là nó lại có nối đôi nằm đúng ở vị trí C-1. Ngay từ những nghiên cứu mở
đường của mình, Kim và các cộng sự đã xuất phát từ axit shikimic để tổng hợp ra một
loạt các hợp chất tương tự với axit sialic dẫ
n tới sự phát minh ra oseltamivir (sơ đồ 1).
Trong quá trình này nhóm 3-isopentyl ete được kiến thiết bằng phản ứng mở vòng
tritylaziridin của 15 với 3-pentanol và xúc tác axit, cho phép nhanh chóng tạo ra hàng
loạt các hợp chất có cấu trúc tương tự bằng cách thay đổi các tác nhân nucleophil.
Sơ đồ 1. Tổng hợp oseltamivir từ axit shikimic theo Kim và các cộng sự [28]
COOHHO
HO
OH
COOCH
3
RO COOCH
3
MOMO
RO
N
3
COOCH
3
MOMO
COOCH

Cl, DIPEA, CH
2
Cl
2
;
c) NaN3, NH
4
Cl, MeOH/H
2
O; d) MeSO
2
Cl, Et
3
N, CH
2
Cl
2
; e) Ph
3
P, THF then Et
3
N/H2O; f) NaN
3
, NH
4
Cl, DMF;
g) CH
3
OH, HCl; h) TrCl, Et
3

15 16
1
13:
R = MOM
14:
R = H
g
8:
R = H
9:
R = MOM
b
10:
R = H
11:
R = Ms
d
h, i
k,l
m, n

Tiếp sau đó Rohloff và các cộng sự (hãng Gilead) đã xây dựng một phương
pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở qui mô pilot (sơ đồ 2). Những điểm
đặc biệt của phương pháp này là:
a) Kiến thiết nhóm thế không phân cực 3-isopentyloxy thông qua hợp chất 3,4-
isopentyliden xetan 17, kế tiếp bằng một phản ứng khử hoá mở vòng xetan kiểu mới,
có tính chọn lựa vị trí cao;
b) Áp dụng hoá học azit để m
ở vòng epoxit và tạo ra các nhóm chức amin ở các vị trí
C-4 và C-5 thông qua hợp chất chìa khoá 4,5-aziridin 21. Với phương pháp này các tác

3
PO
4
a, b, c
d
e
f
g
h
k, l
22:
R = H
23:
R = Ac
i
7
17
18
19
20
21
a) EtOH, SOCl
2
; b) 3-pentanone, TsOH; c) MsCl, Et
3
N; d) TMSOTf, BH
3
.Me
2
S; e) KHCO

PO
4

Sau khi hãng Gilead nhượng lại bản quyền phát minh cho hãng Roche,
Federspiel cùng các cộng sự ở hãng Roche đã giữ nguyên phương hướng tổng hợp này
và nghiên cứu các phương pháp để nâng qui mô sản xuất và nâng cao hiệu suất tổng
hợp hợp chất chìa khóa epoxit 19. Kết quả đã hoàn thiện được quá trình tổng hợp
epoxit 19 từ axit shikimic qua 6 công đoạn, đạt hiệu suất tổng thể 63-65% [33].
Phương pháp này đã được hãng Roche áp dụng để sản xu
ất thuốc Tamiflu ở qui mô
công nghiệp.
Tuy hóa học azit từ lâu đã được áp dụng trong sản xuất, nó luôn tiềm ẩn những
nguy cơ do các tác nhân và các hợp chất azit trung gian có độc tính và có khả năng
phát nổ. Hãng Roche cũng phải thuê các nhà máy hoá chất chuyên dụng để thực hiện
các công đoạn này trong sản xuất [34]. Hạn chế đó đã thúc đẩy các nhà khoa học tìm
ra các phương pháp tổng hợp oseltamivir không qua con đường azit. Năm 2001, Karpf
và Trussardi (hãng Roche) đã thành công trong việc xây dựng một ph
ương pháp như
thế. Quá trình tổng hợp đi từ epoxit được trình bày trên sơ đồ 3. Phương pháp này sử
dụng một axit Lewis mới và rẻ tiền là MgBr
2
.OEt
2
làm xúc tác để mở vòng oxiran của
19 với allylamin . Tiếp theo là phản ứng deallyl hóa bằng xúc tác Pd/C để tạo ra amino
ancol 25. Việc đưa thêm nhóm amin thứ hai vào phân tử được thực hiện thông qua một
loạt các phản ứng kế tiếp nhau bao gồm một chuỗi phản ứng kiểu domino có cơ chế
bảo vệ bằng các nhóm imino trung gian. Hiệu suất tổng thể từ epoxit 19 đạt 35-38% tỏ
ra ưu việt hơn hiệu su
ất đạt được bằng con đường azit (27-29%).

k, l
(97%)
(77%)
(80%)
(83%)
(76%)
19 24
25 26
27
1.
H
3
PO
4
a) allylamine, MgBr
2
.OEt
2
, t-BuOMe / MeCN 9:1,
55
o
C, 16 h; b) (NH
4
)
2
SO
4
/ H
2
O; c) Pd/C, EtOH,

NCH
2
CH
2
OH, reflux, 3 h; l) H
3
PO
4
, EtOH.

Năm 2004, Harrington và các cộng sự thuộc hãng Roche lại xây dựng thành
công một phương pháp tổng hợp oseltamivir mới cũng tránh được con đường azit.
Phương pháp này được các tác giả gọi là "phương pháp thế hệ thứ hai" và có quá trình
phản ứng trình bày trên sơ đồ 4.
Phương pháp này sử dụng tert-butylamin cùng với magiê clorua để mở vòng
oxiran của epoxit 19 và sử dụng diallylamin cùng với axit p-toluensulfonic để mở
vòng aziridin của 29. Nhóm amin tự do thứ nhất tại C-4 đượ
c tạo ra bằng cách tách
loại nhóm tert-butyl dưới tác động của axit. Nhóm amin thứ hai được tạo ra do chuyển
dịch của nhóm allyl liên kết với nó sang axit 1,3-dimethylbarbituric dưới tác dụng của
hệ xúc tác đồng pha Pd(0)-phosphin. Hiệu suất tổng thể của cả quá trình đạt 61%.

Sơ đồ 4. Tổng hợp oseltamivir từ epoxit theo Harrington và các cộng sự [36]
COOEtO
O
COOEtO
COOEtO
HO
NHt-Bu
COOEtO

PO
4
31
32
a
b
c
d
fg, h
a) t-BuNH
2,
MgCl
2
, toluene; b) MsCl, Et
3
N, toluene; c) PhSO
3
H, (allyl)
2
NH; d) Ac
2
O, NaOAc; e) HCl / EtOH; f) TFA; g)
NDMBA, Pd(OAc)
2
, PPh
3
; h) H
3
PO
4

COOH
OH
COOCH
3
OH
HO
HO
OTs
HO
c, d
COOCH
3
COOCH
3
O
e
35:
R = H
36:
R = Ts
b
34 37 8
a
a) Shing, T. K.; Tang, Y. Tetrahedron 1990, 46, 6575; b) TsCl, DMAP, pyridine; c) SO
2
Cl
2
, pyridine; d) p-TsOH, CH
3
OH;

17
34
42
38: R = H
39: R = Ms
b
40: R = H
41: R = Ms
d
e
f
a
c
(90%)
(80%)
(42%)
(95%)
a) 2.2-DMP, TsOH; b) MsCl; c) EtOH, EtONa;
d) MsCl; e) SO
2
Cl
2
, pyridine; f) 3-pentanone, HClO
4
. Các công trình nghiên cứu tiếp theo của Federspiel và các cộng sự (công ty
Roche) đã nâng hiệu suất của toàn bộ quá trình dẫn đến hợp chất chìa khoá epoxyt 19