THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI
TRONG PHẢN ỨNG PCR
BẰNG FASTPCR VÀ
DNA CLUB
Mục tiêu của bài học

Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA
khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác)

Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm
Tìm kiếm trình tự sinh học
2
Quá trình sao chép DNA trong tế bào
Giới thiệu môn học
3
Qui trình phản ứng PCR
Giới thiệu môn học
4
Các vi sinh
vật,
động vật
Thu nhận mẫu
Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và
cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do
chính phát minh này Mullis đã được trao
giải nobel vào năm 1993
Thành phần trong phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện khi có:

DNA mẫu


Phản ứng PCR gồm có 3 giai
đoạn:
• Biến tính DNA mẫu T=94
0
C
• Bắt cặp mồi Tm = 55
0
C-65
0
C
• Giai đoạn kéo dài, tổng hợp
DNA mới T kéo dài =70
0
C
Mục đích, nguyên tắc

Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5'
hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào
2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần
khuếch đại.
Giới thiệu môn học
9
Forward primer
Reverse primer
Đoạn DNA cần khuếch đại
Primer là gì?

Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả năng bắt cặp
bổ sung với DNA khuôn


13
Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt
độ lai thích hợp
Nhiệt độ của primer
1. Nhiệt độ nóng chảy:
Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa bắt cặp
với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/(chiều dài
nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA, thường nhiệt độ nóng
chảy từ 55-65
0
C.
2. Nhiệt độ bắt cặp:
Tanneal:Là nhiệt độ của đoạn mồi bắt cặp với DNA khuôn
Tanneal= Tm-primer -4
0
C
Giới thiệu môn học
14
Tính ổn định

Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp của mồi T
anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR thành
công và thu được sản phẩm khuếch đại (một số lượng lớn bản sao
của đoạn DNA dùng làm khuôn ban đầu).


Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu
cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tốn thưòi gian
và công sức. Công việc này trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ
các phần mềm thiết kế mồi.

Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ sở
dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer qua những phần
mềm thiết kế PCR
Giới thiệu môn học
18
Trình tự DNA khuôn
- Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật
- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh vật và
vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt

Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat
stable) và heat labile (LT) bảo tồn cao
Ví dụ 2: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E.
coli (EPEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enterohemorrhagic
E. coli (EHEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC) chọn ra những
gene đặc trưng cho từng loài ETEC, EPEC, EIEC và EHEC.19
Tìm kiếm trình tự sinh học
Tính tương thích

Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược. Chúng sử được
sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR.

Một đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là nhiệt độ bắt
cặp (Tanneal)

Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và mồi ngược
Giới thiệu môn học