1

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINH ỨNG DỤNG

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 2

- 2009 -
3

I. Lý thuyết
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo
thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không
sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn
và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các
amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản
phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH
3
và H
2
S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và
Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó,
vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống
Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình
amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.

II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các
mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.
Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm
tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus –
giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của
khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này.
1. Môi trường - hóa chất
Môi trường canh thịt- peptone:
Cao thịt 5g

5
– 10
10

Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử
trùng ở trên
Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống
nghiệm
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
 Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
2
– 10
5

Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên
Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng
6

4. Quan sát và ghi nhận kết quả
Đối với môi trường lỏng, quan sát:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, kết cạn
Nổi váng trên bề mặt

Số khuẩn lạc đặc trưng
Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng
Độ pha
loãng
Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc
đặc trưng
Hình thái
khuẩn lạc
Xuất hiện
bào tử
Khả năng di
động
Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch
7BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
I. Lý thuyết
Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH
3
thành HNO
3
, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt
động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO
2
. Hầu hết các vi sinh vật tự

. Nguyên liệu năng lượng và
nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH
3
và muối amon, còn
đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit.
Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào
môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới
hạn.
8

1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Winogradski:
(NH4)
2
SO
4
2 g/l
K
2
HPO4 1 g/l
MgSO4 0,5 g/l
FeSO4 0,4 g/l
NaCl 2 g/l
Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO
3
. Hấp khử trùng ở 1 atm
Dung dịch pha loãng mẫu
Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật
Tinh thể diphenylamin
H

số
Độ pha loãng
10
2
10
3
10
4
10
5

NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-

Achromobacter, Micrococcus …

II. Thực hành
Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng
phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất
khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử
dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron
nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4
+
. Vì vậy,
trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc
muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy.
Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
1. Môi trường- hóa chất
Môi trường Giltay:
Dung dịch A:
Asparagine: 1g
KNO
3
: 1g
Nước máy: 0.25l
Dung dịch B:
KNO
3
: 8,5g
K
2
HPO
4
: 1g

của môi trường
Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin
Độ pha loãng Đục môi trường Sinh khí pH môi trường NO
3
-
10
3

10
5

10
7

10
9 Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình thái
học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được.
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin:
Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch
nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm.
12BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ
I. Lý thuyết
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế

2
O.
13

Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng
ở đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có thể phát triển trong môi trường với
pH 3.
Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất
khô hạn.
Việc phát hiện Azotobacter được thực hiện trên môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không
chứa nitrogen hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ ẩm cao.
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N
2
-free glucose) tăng sinh
K
2
HPO
4
: 1g
MgSO
4:
0,2g
FeSO
4
: 0,2g
CaCl
2
: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g

sinh dưới kính hiển vi quang học. Nếu có đúng hình thái khuẩn lạc, chuyển sang môi trường phân
lập.
14

- Giai đoạn phân lập: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường Thompson-Sherman phân lập đã phân
vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày, 30
O
C.
3. Quan sát ghi nhận kết quả
Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuẩn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.
Hình
dạng
tế bào
Bào tử Kích
thước
Sự sắp
xếp tế
bào
Có roi Di động Bao
nhầy
Hình
vẽ tế
bào
Loại 1

Loại 2
Ghi nhận các loại khuẩn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả các khuẩn lạc đó

Hình
vẽ tế
bào
Loại 1

Loại 2

BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
15

I. Lý thuyết
Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy
mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có
vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon.
Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc acid, độ ẩm
thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô cơ hóa cellulose đều thuộc
loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác việc phân giải cellulose thành
cellobioase và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng
lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số
đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm Trong đó, quan trọng
nhất là niêm khuẩn.
Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn,
thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Trên cơ chất đặc niêm khuẩn
có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuẩn
có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành
những tế bào dạng nghỉ, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.

Nước máy 1000ml
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị các đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 1 atm.
Giấy lọc cắt thành những khoanh tròn kích thước tương ứng đĩa petri. Hấp khử trùng ở 1 atm.
Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù
Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 10
1
đến 10
10
, trang đều lên bề mặt bằng que cấy trang.
Sau đó dùng kẹp sắt đã khử trùng trên ngọn lửa gấp 1 khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp sát lên bề
mặt. Mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.
Đậy nắp đĩa petri đặt vào bình hút ẩm. Nuôi cấy 28-30
O
C trong 12-14 ngày đêm.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc trong mỗi đĩa petri.
Xác định xem khuẩn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuẩn, xạ khuẩn hay nấm khuẩn ty)
chiếm ưu thế trên giấy lọc. Để phân biệt các khuẩn lạc nhỏ của xạ khuẩn và nấm, có thể quan sát
trên kính hiển vi với vật kính 8X. Nhận xét sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được.
Khuẩn lạc
loại
Hình dạng Kích thước Màu sắc Mức độ phân
giải cellulose
Số khuẩn lạc cùng
loại ghi nhận được
(khuẩn lạc/đĩa)
Loại 1

Loại 2

quan tâm rất nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mẻ này.
Vi sinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH). Người
ta chia sự phát triển của CNSH ra thành 3 giai đoạn:
* CNSH truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến , bảo quản các loại thực
phẩm, xử lý đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp
* CNSH cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô
lớn các sản phẩm sinh học như mỳ chính (bột ngọt), lizin và các axít amin khác, các acid hữu cơ,
các dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, một số vitamin (như vitamin B2, B12, C ), nhiều loại
enzym
* CNSH hiện đại chia ra các lĩnh vực như CN di truyền (genetic engineering), công nghệ tế
bào (cell engineering), công nghệ enzym và protein (enzyme/protein engineering), CN vi sinh vật/
CN lên men (microbial engineering / fermentation), CN môi trường (environmental engineering).
CNSH hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gen tái tổ hợp ( recombination gene).
Vi sinh vật học là khoa học nghiên cứu về các cơ thể hoặc các nhân tố quá nhỏ đến mức
không thấy được bằng mắt thường, tức là các vi sinh vật. Vi sinh vật học đang được giảng dạy
trong rât nhiều trường Đại học, Cao đẳng, Trung học chuyên nghiệp và cũng được đề cập đến ít
nhiều ở bậc phổ thông. Vi sinh vật học là những kiến thức liên quan đến cuốc sống của mọi người.
Bên cạnh giáo trình Vi sinh vật học đã được biên soạn từ lâu và đã được tái bản nhiều lần chúng
tôi muốn cung cấp thêm cho đông đảo bạn đọc, nhất là các thầy cô giáo đang giảng dạy về vi sinh
vật học tập tài liệu trình bày với nhiều tranh ảnh và sơ đồ, biểu đồ này. Có thể coi đây là phần
tham khảo để thiết kế các bài giảng nhằm mục tiêu cập nhật với các tiến bộ của ngành khoa học
luôn luôn đổi mới này.
Để giúp các bạn trẻ tiếp cận được với sách báo nước ngoài, nhất là cập nhật kiến thức qua
Internet chúng tôi cố gắng viết thêm tiếng Anh sau các thuật ngữ khoa học và để nguyên các chú
thích tiếng Anh trong hình vẽ. Thông qua việc giáo viên hướng dẫn sinh viên điền tiếng Việt vào các
hình vẽ sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình tự học của sinh viên.
Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các bạn đồng nghiệp và đông đảo bạn đọc.
Vì mục đích phục vụ phi lợi nhuận chúng tôi mong được lượng thứ việc đã sử dụng những
hình ảnh thu nhận qua Internet.


1869- Miescher khám phá ra acid nucleic.
1876-1877-

Robert Koch (1843-1910) chứng minh bệnh than do vi khuẩn Bacillus
anthracis gây nên.
1880- Alphonse Laveran phát hiện ký sinh trùng Plasmodium gây ra bệnh sốt rét.
1881- Robert Koch nuôi cấy thuần khiết được vi khuẩn trên môi trường đặc chứa gelatin.
Pasteur tìm ra vaccin chống bệnh than.
1882- Koch phát hiện ra vi khuẩn lao - Mycobacterium tuberculosis.
1884- Lần đầu tiên công bố Nguyên lý Koch.
Elie Metchnikoff (1845-1916) miêu tả hiện tượng thực bào (phagocytosis)
Triển khai nồi khử trùng cao áp (autoclave)
Triển khai phương pháp nhuộm Gram.
1885- Pasteur tìm ra vaccin chống bệnh dại.
Escherich tìm ra vi khuẩn Escherichia coli gây ra bệnh tiêu chảy.
1886- Fraenkel phát hiện thấy Streptococcus pneumoniae gây ra bệnh viêm phổi.
1887- Richard Petri phái hiện ta cách dùng hộp lồng (đĩa Petri) để nuôi cấy vi sinh vật .
1887-1890- Winogradsky nghiên cứu về vi khuẩn lưu huỳnh và vi khuẩn nitrat hoá.
1889- Beijerink phân lập được vi khuẩn nốt sần từ rễ đậu.
1890- Von Behring làm ra kháng độc tố chống bệnh uốn ván và bệnh bạch hầu.
1892- Ivanowsky phát hiện ra mầm bệnh nhỏ hơn vi khuẩn (virus) gây ra bệnh khảm ở cây
thuốc lá.
1894- Kitasato và Yersin khám phá ra vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Yersina pestis).
1895- Bordet khám phá ra Bổ thể (complement)
1896- Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn Clostridium botulinum).
1897- Buchner tách ra được các men (ferments) từ nấm men (yeast).
Ross chứng minh ký sinh trùng sốt rét lây truyền bệnh qua muỗi.
1899- Beijerink chứng minh những hạt virus đã gây nên bệnh khảm ở lá thuốc lá.
1900- Reed chứng minh bệnh sốt vàng lây truyền do muỗi.
1902- Landsteiner khám phá ra các nhóm máu

Medawar khám phá ra hiện tượng nhờn miễn dịch (immune tolerance).
Watson và Crick khám phá ra chuỗi xoắn kép của ADN
1955- Jacob và Monod khám phá ra yếu tố F là một plasmid.
Jerne và Burnet chứng minh lý thuyết chọn lọc clone (clonal selection).
1959- Yalow triển khai kỹ thuật Miễn dịch phóng xạ.
1961- Jacob và Monod giới thiệu mô hình điều hoà hoạt động gen nhờ operon.
1961-1966- Nirenberg, Khorana và cộng sự giải thích mã di truyền.
1962- Porter chứng minh cấu trúc cơ bản của Globulin miễn dịch G.
Tổng hợp được quinolone đầu tiên có tác dụng diệt khuẩn ( acid nalidixic).
1970- Arber và Smith khám phá ra enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Temin và Baltimore khám phá ra enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase)
1973- Ames triển khai phương pháp vi sinh vật học để khám phá ra các yếu tố gây đột biến
(mutagens).
Cohen, Boyer, Chang và Helling sử dụng vectơ plasmid để tách dòng gen ở vi khuẩn.
1975- Kohler và Milstein phát triển kỹ thuật sản xuất các kháng thể đơn dòng ( monoclonal
antibodies).
Phát hiện ra bệnh Lyme.
1977- Woese và Fox thừa nhận Vi khuẩn cổ (Archaea) là một nhóm vi sinh vật riêng biệt.
Gilbert và Sanger triển khai kỹ thuật giải trình tự ADN (DNA sequencing)
1979-Tổng hợp Insulin bằng kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
Chính thức ngăn chặn được bệnh đậu mùa.
1980- Phát triển kính hiển vi điện tử quét
1982- Phát triển vaccin tái tổ hợp chống viêm gan B.
1982-1983- Cech và Altman phát minh ra ARN xúc tác.
1983-1984- Gallo và Montagnier phân lập và định loại virus gây suy giảm miễn dịch ở
người.
Mulli triển khai kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction).
1986- Lần đầu tiên ứng dụng trên người vaccin được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền
(vaccin viêm gan B).
1990- Bắt đầu thử nghiệm lần đầu tiên liệu pháp gen (gene-therapy) trên người.

phản đối thuyết tự sinh
(Pasteur)
Robert Koch (1843-
1910)

Vi khuẩn lao chụp qua
kính hiển vi

Elie Metchnikoff
(1845-1916)

Alexander Fleming (1881-1955)

Nấm Penicillium sản