VIỆN NC DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CÂY PHÔI
DỪA SÁP MAKAPUNO (COCOS NUCIFERA L.)
GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ VƯỜN ƯƠM Cnđt : TRẦN THỊ NGỌC THẢO

8281


193.RD/HĐ-KHCN ký ngày 16/03/2009 giữa Vụ Khoa Học và Công Nghệ,
Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu về
việc thực hiện
nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ có tên: Nghiên cứu cải tiến qui
trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai
đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm.
- Căn cứ vào Hợp đồng giao khoán nội bộ số 08/HĐGK-VD ký ngày
07/04/2009 giữa Viện Trưởng Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu với Chủ
nhiệm đề tài về việc giao khoán thực hiện nhiệm vụ Nghiên cứu Khoa học và
Phát triển công nghệ Cấp Bộ năm 2009 có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình
công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn
phòng thí nghiệm và vườn ươm.
Mục tiêu chung của đề tài:
Nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa Sáp bằng phương pháp nuôi cấy phôi ở giai
đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm. Dự kiến đạt 30- 35%.
Mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cả
i tiến ở giai đoạn
phòng thí nghiệm đạt tỷ lệ phôi nảy mầm và phát triển thành cây trong
phòng thí nghiệm dự kiến tăng 20-30% so với qui trình hiện có.

2
- Rút ngắn thời gian nuôi trồng trong phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống của cây dừa sáp nuôi cấy phôi ở giai đoạn
vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, xác định nhiệt
độ, độ ẩm ở vườn ươm và lựa chọn tổ hợp phân bón phù hợp cho sự tăng
trưởng của cây dừa sáp nuôi cấy phôi.
- Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi d
ừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí
nghiệm và vườn ươm, đạt tỷ lệ 30-35%

Việc nuôi cấy in vitro phôi dừa hợp tử (zygotic) đã được nhiều tác giả
nghiên cứu thành công từ những năm trước đây như De Guzman và Del Rosario
(1974), Assy Bar (1986), Rillo và Paloma (1992), Samosir và cộng sự (1999).
Các nghiên cứu này nhằm mục đích cứu lấy những phôi hữu tính phát triển bình
thường từ những quả dừa đột biến nhưng có giá trị cao như dừa Sáp (makapuno)
trong khi nội nhũ (c
ơm dừa) lại mềm, xốp và không có chức năng (Rillo và
Paloma, 1992) để từ đó tạo ra những cây giống cho tỷ lệ trái sáp cao. Ngoài ra
phương pháp này còn được áp dụng trong việc chọn lựa in vitro các tính trạng
cây trồng khác nhau và bảo quan gen dừa ở nhiệt độ thấp.
Từ nhiều năm nay, Mạng luới gen dừa quốc tế - Viện Quỹ gen thực vật
Quốc tế (COGENT-IPGRI) đã tài trợ vốn và thiết l
ập ngân hàng bảo tồn nguồn
gen dừa quốc ở nhiều nơi (ICG). Mạng lưới các điểm bảo tồn này, trong đó có
nhiều nơi đã đi vào hoạt động nằm trong 5 khu vực của COGENT là Đông Nam
Á, Nam Á, Nam Thái Bình Dương, Châu Phi, Ấn Độ Dương, Châu Mỹ La Tinh
và vùng Caribe. Mạng lưới ngân hàng gen dừa này sẽ là nơi lưu giữ phần lớn
nguồn gen dừa của thế giới và bảo vệ chúng cho việc s
ử dụng trong tương lai
của ngành công nghiệp dừa. Để hỗ trợ cho việc thành lập các ngân hàng bảo
tồn gen dừa, việc thu thập nguồn gen bằng phôi mầm riêng biệt hoặc những
miếng nội nhũ nhỏ có chứa phôi và di chuyển chúng như trong trường hợp nuôi
cấy phôi trong ống nghiệm (in vitro) đã trở thành một biện pháp mang tính thực
tế hơn nhiều trong công đoạn vận chuyển gen dừa v
ừa gọn nhẹ, dễ dàng, vừa an
toàn về mặt kiểm dịch thực vật.
Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa tiêu chuẩn quốc tế đã được sử
dụng để lập ra bộ sưu tập nguồn gen dừa và sản xuất các cây giống chất lượng
cao từ những giống dừa đột biến như dừa Sáp (makapuno). Phương pháp này
được gọi là “Kỹ thuật nuôi cấ

nghiên cứu Dầu và cây có dầu) đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa trong điều kiện
in vitro từ năm 1999 trên 2 giống dừa là Ta xanh và Lùn vàng Mã Lai.
Từ năm 2000 đến 2001,
được sự tài trợ của IPGRI-COGENT, Nhóm tác
giả trên đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa Sáp (Makapuno), dừa Ẻo trong điều
kiện in vitro.
Đến năm 2003-2004, nhóm tác giả trên tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện,
nâng cao qui trình nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm thông qua việc tìm môi
trường thích hợp cho nuôi cấy phôi dừa Sáp và dừa Dứa, nghiên cứu ảnh hưởng
của thời gian trữ lạnh đến khả năng nảy mầm của phôi dừa Sáp. Bên cạnh đó,
nhóm tác gi
ả còn nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng, chế độ tưới, chế độ
ánh sáng, độ ẩm đến tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở vườn ươm. Từ đó
cho thấy, việc tìm ra điều kiện nuôi trồng của vườn ươm giúp cây dừa cấy phôi
thích nghi với điều kiện ex-vitro là một vấn đề khó khăn nhưng lại rất thi
ết thực.
Song song đó, với sự tài trợ của Trường Đại học Queensland (Australia)
thông qua dự án ACIAR thực hiện từ năm 2003-2005, nhóm tác giả này đã
nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự tạo rễ của phôi dừa Dứa và
Xiêm, nghiên cứu ảnh hưởng của việc cắt dây treo (haustorium) của phôi trong
quá trình nuôi cấy để hạn chế tỷ lệ chết của cây dừa nuôi cấy phôi khi chuyển ra
vườ
n ươm.
Và thông qua dự án Phát triển sản xuất giống Dừa (giai đoạn 2001-2005)
của Bộ Công Nghiệp, nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và
cộng sự đã nghiên cứu nuôi trồng 2 giống dừa quý là Sáp và Dứa, hiện nay đã
trồng ra đồng được khoảng 5ha.
Tuy nhiên, cho đến nay tỷ lệ thành công vẫn chưa cao. Từ phôi mới đưa
vào nuôi cấy cho đến khi cây trưởng thành để trồng ra
đồng là 19-20%.

dưỡng bằng môi trường mới giàu dinh dưỡng hơn, tạo điều kiện cho cây phát
triển khỏe m
ạnh và cân đối.
Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm là cây
phải đạt kích thước về chiều cao cây ≥ 15cm, đã có 3 lá mở hoàn toàn và đã có
rễ thứ cấp.
Kết thúc giai đoạn nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm, tỷ lệ phôi sống
sót và phát triển thành cây là khoảng 40%.
Giai đoạn 3
: Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm.
Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm nên
cần có một giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm. Các cây dừa con được
cấy vào môi trường Y3 có nồng độ đường 4,5% và được đặt vào điều kiện
phòng thí nghiệm có nhiệt độ 30
o
C, độ ẩm 60% và cường độ chiếu sáng 5.000
lux. Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm được thực hiện khoảng 1-2
tháng.
Giai đoạn 4 :
làm cây thích nghi ở vườn ươm
Cây dừa trong phòng thí nghiệm được đem ra trồng trong các túi PE 15
có pha cát, xơ dừa, phân chuồng theo tỷ lệ (1:1:1). Nuôi trồng cây dừa trong
bịch PE khoảng 4 tháng. Cây sống sót từ giai đoạn này đạt 60-70%.
Giai đoạn 5
: Trồng ở vườn ươm
Sau khi trồng thích nghi ở vườn ươm, các cây con được chuyển sang giá
thể trồng khác là đất và được trồng trong túi PE 25
Cây sống sót ở giai đoạn này đạt 80-90%.
Cây con đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn trồng là cây có chiều cao ≥ 40cm, cây
có ít nhất 5 lá xanh, chu vi gốc ≥ 10cm

7
Quy trình nuôi cấy phôi dừa sáp năm 2001-2005:


50ml môi trường Y3 + IBA 2mg/l
ĐK : 28
±
2
0
C, 4000lux, 9h/ngày
Túi PE 30, giá thể: đất, 6 tháng.
100%
80-90%
60%-70%
40%
80%
Tỷ lệ đạt
được 19,2%
Chọn trái 9 tháng tuổi, không
sâu bệnh Tách phôi khử trùng
với javel 10 đến 15 phút.
10 lần

8
Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong phòng thí nghiệm có đủ điều kiện
để đưa ra vườn ươm là:
• Cây phát triển xanh tốt.
• Cây lá và rễ phát triển cân đối
• Cây đã có 3 lá mở và có rễ phụ
Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong vườn ươm đủ tiêu chuẩn để đưa ra
vườn trồng khi:
• Cây phát triển xanh tốt, không sâu bệnh.
• Cây đạt chiều cao ≥ 40cm
• Cây có 5-6 lá xanh

9
Dừa Sáp Makapuno có giá trị kinh tế cao, phục vụ cho các ngành du lịch,
chế biến thực phẩm…, giá thành của một trái dừa sáp cao gấp 20-30 lần một
trái dừa thường. Hiện nay, dừa sáp được mệnh danh là loại dừa mắc nhất Việt
Nam với giá dao động từ 100.000đ đến 120.000đ/trái. Đây là loại trái giải khát
độc đáo của Huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh, không đâu có thể sánh được, kể cả
xứ s
ở nổi tiếng về dừa là Bến Tre. Tất cả các phần của cây dừa sáp từ thân, lá,
trái, vỏ, xơ, gáo, nước… đều có thể sử dụng phục vụ đời sống con người. Do
vậy, với giá thành hiện tại của trái dừa sáp cùng với hương vị thơm ngon của
trái dừa sáp đã phần nào giúp đỡ cho tiềm năng du lịch tại địa phương phát
triển. Bên cạnh đó cũ
ng giải quyết được công ăn việc làm, ổn định về đời sống
kinh tế cho người nông dân.
Hiện nay, Philippines là quốc gia hàng đầu về sản xuất cây dừa Sáp nuôi
cấy phôi, với 10 phòng thí nghiệm chuyên sản xuất giống dừa này nhưng vẫn
chưa đủ giống cung cấp cho nhu cầu sản xuất và giá cây dừa giống vẫn còn khá
cao, chỉ một số công ty tư nhân mới đủ khả năng đầu tư
trồng dừa Sáp và phải
đặt mua cây giống trước 1-2 năm.

Bảng 1.1: Giá cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở các nước khác

Năm Quốc gia Giá trái Sáp Giá cây dừa NCP
Philippines
30 Peso/trái
(~0,65USD/trái)
500 Peso/cây (~11 USD/cây)
2007
Indonesia 2-3 USD/trái 30 USD/cây

trong quá trình nuôi cấy cho đến lúc ra vườn ươm, phát triển thành cây, hoa và
trái. Do vậ
y, công tác chọn phôi phải thật nghiêm ngặt. Phải chọn phôi dừa sáp
từ những quả dừa sáp không quá non, không quá già, không bị thối nhũn. Trái
giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh. Trái đủ độ chín, khoảng 10-11 tháng
tuổi.
1.5.2 Sự hóa nâu:
Dừa là loài thực vật giàu các hợp chất polyphenol (tanin hay các
hydroxyphenol). Sau khi phôi bị tổn thương trong quá trình cắt và khử trùng,
các hợp chất này bị oxid hóa bởi các oxydase chứa gốc đồng (Cu) như
polyphenoloxydase. Các hoạt động oxid hóa đượ
c tạo thành sẽ cản hoạt động
của các enzyme trong mô làm mô và môi trường nuôi cấy bị hóa nâu hay đen
trong vòng vài ngày sau đó, mô không thể tăng trưởng và sẽ chết. Các
polyphenol oxydase có thể tổng hợp mới hay hiện diện sẵn và phóng thích do
sự tác động của vết thương.
Có thể hạn chế sự hóa nâu bằng cách:
- Loại bỏ các hợp chế phenol (phenolic) sinh ra.
- Thay đổi thế oxid khử.
- Bất hoạt hóa các enzyme phenolase
-
Giảm hoạt tính phenolase
- Loại đài chất của phenolase.
Trong thực tế, phương pháp dễ nhất để cản sự hóa nâu của mô thực vật là
loại các hợp chất phenol sinh ra, có thể thực hiện bằng nhiều cách:
Mô cấy được chuyển thường xuyên trong 2-4 tuần lễ đầu. Sự cấy chuyền sẽ
dễ thực hiện hơn nếu mô cấy được đặt vào môi trường lỏng (nuôi cấ
y lắc).

11

thay đổi từ 3-6 mM.
Nitơ còn có tác động nhiều mặt đến sự đồng hóa CO
2
. Khi thiếu Nitơ cường
độ đồng hóa CO
2
giảm, làm giảm cường độ quang hợp. Khi cung cấp nitơ làm
cây tổng hợp Auxin tăng lên.
Nếu mô cấy hấp thu nitơ vượt quá nhu cầu thì sẽ mềm mỏng. Tuy nhiên nếu
không cung cấp đủ lượng cấn thiết thì mô cấy sẽ bị cứng do thừa cenllulose và
ligin ở thành tế bào.
Khi thiếu nitơ thì thân mô cấy kém phát triển, mô có màu xanh nhạt, lá có
màu vàng, phiến lá mỏng, ảnh hưởng đến quang hợp.
Phospho (P):

Phospho có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng, cần thiết cho sự phân
chia tế bào, sự phát triển của rễ. Phospho có liên quan đến sự tổng hợp đường,
tinh bột vì phospho là thành phần của các hợp chất cao năng tham gia vào các
quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu cơ trong tế bào

12
Khi thiếu phospho lá cây có màu xanh đậm do sự thay đổi tỷ lệ diệp lục tố a
và b. Ở môi trường có pH thấp, nhiều sắt thì dễ bị thiếu phospho vì làm
phospho ít linh hoạt. Sự thiếu phospho thường đi theo sự thiếu nitơ và có triệu
chứng gần tương tự nhau vì phospho liên quan đến sự biến dưỡng nitơ.
Hai dạng muối phospho thường dùng nhất là NaH
3
PO
4
.7H

Canxi là thành phần muối pectate của tế bào (pectate calcium) có ảnh hưởng
trên tính thấm của màng. Canxi cần cho sự thâm nhập của NH
4
+
và NO
3
-
vào rễ.
Canxi là ion kém linh động nên màng tế bào thực vật hấp thu dễ dàng.
Canxi được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.6H
2
O hoặc
CaCl
2
.2H
2
O. Nồng độ Ca
2+
trong môi trường nuôi cấy từ 1-3.5 mM, trung bình
là 2mM.
Magie (Mg):


2
SO
4
Các khoáng vi lượng
Kẽm (Zn):

Tham gia trong quá trình tổng hợp auxin, vì kẽm có liên quan đến hàm lượng
tryptophan, amino acid tiền thân của quá trình sinh tổng hợp NAA.
Kẽm có tác dụng đến nhóm GA3, có liên quan đến sinh tổng hợp vitamin
nhóm B1, B2, B6, B12. Ngoài ra còn ảnh hưởng tốt đến độ bền của diệp lục tố,
tác dụng tốt đến tổng hợp carotenoid. Kẽm còn vận chuyển các sản phẩm quang
hợp từ lá xuống các cơ quan dự trữ, tăng khả năng giữ nước, độ ng
ậm nước của
mô do làm tăng quá trình tổng hợp các cao phân tử ưa nước như protein, nucleic
acid.
Khi thiếu kẽm thì cường độ tổng hợp tryptophan từ indol và serine bị kiềm
hãm nên rễ không tạo được hoặc kém phát triển, lá bị bạc màu, sắc tố bị hủy
hoại, lá kém phát triển, hình dạng lá không bình thường, lóng ngắn,…Thường
sử dụng kẽm ở dạng ZnSO
4
.7H
2
O.
Sắt (Fe):

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2,
FeCl
3
.6H
2

thấy có sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa các lượng khác nhau sắt và mangan và cần
phải phòng ngừa trước để để chắc chắn rằng sự cân đối giữa mangan và sắt là
không đổi trong giới hạn phát triển tốt nhất của cây trồng.
Bor (B)

Bor liên quan trong sự tổng hợp các acid nucleic, các phản ứng hormon và
các chức năng của màng, trong sự cận chuyển carbohydrat, và trong sự dùng
calcium cho sự thành lập vách.
Thiếu Bor, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mô đen xảy ra ở lá non (chủ
yếu ở gốc lá) và rễ phù to, cây có thể mất ưu tính ngọn.
Molypden (Mo)

Mo là thành phần của nitrat reductase.
Thiếu Mo, có sự hoàng hóa và hoại mô ở các lá già.
Nguồn Carbon:
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên
các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải do quá trình
quang hợp cung cấp mà do đường trong môi trường. Đường được sử dụng như
nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy phôi.
Hai dạng đường thường được sử dụng nhất là saccharose và glucose nh
ưng
hiện nay saccharose được dùng phổ biến hơn vì 2 nguyên nhân chính:
− Sử dụng đường saccharose kinh tế hơn đặc biệt là khi ứng dụng vào
sản xuất vì giá thành đường saccharose thấp hơn.
− Đường saccharose là một disaccharit được cấu tạo từ 2 đường đơn là α-
D-glucose và β-D-fructose. Trong quá trình hấp vô trùng môi trường
với autoclave ở 121
o
C, 1atm, saccharose bị tách thành 2 loại đường
đơn như trên và mô thực vật có thể hấp thu được cả hai loại đường đơn

nồng độ khá cao nên thường đặt ngoài nhóm vitamin.
- Ca-D pantothenate: chất bột trắng, tan trong nước, là dạng phổ biến nhất
của vitamin B3
- Biotin cần trong vài sự carboxyl hóa
Chất điều hoà tăng trưởng thực vật.
Chất điều hoà sinh trưởng th
ực vật (hormone thực vật) là những hợp chất
hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển
tới một nơi khác. Ở đó, với nồng độ rất thấp gây ra một phản ứng sinh lý.
- Ở nồng độ thấp làm biến đổi các hoạt động sinh lý (kích thích, điều hoà
hay cản) các quá trình sinh lý của thực vật.
- Ở nồng độ cao chúng trở thành chất độc cho thực vật (đặc biệt là với con
người).
- Chất điều hoà sinh trưởng nội sinh ít bền và dễ kiểm soát hơn so với các
chất điều hoà ngoại sinh. Do vậy trong thực tế các chất điều hoà tổng hợp
được sử dụng rất phổ biến.
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật đượ
c phân làm 5 nhóm chính là: Auxin,
Cytokinin, Gibberilin, Acid Abscisic và Ethylen. Mỗi chất có những tác dụng
sinh lý khác nhau trên quá trình sinh trưởng của thực vật tự nhiên và thực vật
trong nhân giống in-vitro.

16
Auxin:
Auxin là hormon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934, là một
hợp chất tương đối đơn giản: indol 3 acetic acid (IAA). Auxin được tổng hợp
trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non (tức nơi có sự phân
chia tế bào nhanh) từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh
sáng. Sau đó auxin được di chuyển đến rễ và tích tụ trong rễ.
Auxin chủ yếu của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), ngoài ra còn có

Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA lên sự

17
dãn theo chiều dọc của tế bào, GA kiểm soát hướng đặt các vi sợi cenllulose
mới được tổng hợp trong các tế bào.
- Sự kéo dài lóng và tăng trưởng lá : kích thích kéo dài lóng là đặc điểm nổi
bật của GA. Hoạt động này vừa do sự phân chia tế bào thân. GA kích thích
mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. GA liều cao ( hay phối hợp với
cytokinin) kích thích sự tăng trưởng lá (diện tích có thể gấp đôi bình
thường).
- Sự
phát triển chồi cây và nảy mầm của hạt.
- GA làm chậm hiện tượng ngủ của chồi do ngày ngắn cảm ứng (mùa thu), và
gỡ sự ngủ của các chồi cây gỗ.
- Trong phần lớn các trường hợp, GA có hoạt động bổ sung cho auxin. Thông
thường, GA làm tăng hàm lượng auxin trong các mô mà nó kích thích. Tuy
nhiên, hai chất này có hoạt động độc lập .
Cytokinin:
Cytokinin là hormon thứ ba được phát hiện năm 1963. khi nuôi cấy mô thực
vật, người ta phát hi
ện ra một nhóm chất hoạt hóa sự phân chia tế bào mà thiếu
chúng thì sự nuôi cây mô không thành công, đó là 6-furfurilaminopurin, tức
kinetin. Kinetin chỉ hoạt động khi có auxin hiện diện, không có auxin sự phân
chia tế bào do cytokinin không xảy ra. Ngược lại, không có cytokinin thì auxin
tạo thành các tế bào khổng lồ (không có sự phân vách). Kinetin không có trong
thiên nhiên. Cytokinin tự nhiên chủ yếu là zeatin. Các cytokinin tổng hợp được
sử dụng khá rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin và benzyl adenine
(BA).
Cơ quan tổng hợp cytokinin là hệ thống rễ, từ rễ cytokinin được vận chuyể
n

nồng độ auxin cao. Nó hoạt hoá sự chín
đồng thời kích thích sự phát triển về
phía bên của các tế bào kéo dài.
Acid abscisic:
Là một loại hormone làm chậm sự sinh trưởng, duy trì trạng thái ngủ, có
nguồn gốc từ các tế bào chịu stress.
1.5.4 Tác động của các điều kiện môi trường
Ánh sáng
Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình cây in vitro, nó tác
động đến các quá trình quang hợp và hô hấp của cây. Ánh sáng còn góp phần
vào việc tạo rễ và chồi bất định của các phôi.
Khi thiếu ánh sáng cây sẽ bị hoàng hoá do lá thi
ếu diệp lục tố vì quang hợp
không xảy ra dẫn đến hậu quả là cây sẽ giảm trọng lượng, việc phân hoá mô và
tạo rễ sẽ giảm.
Mặt khác, khi cường độ ánh sáng yếu thì cường độ quang hợp cũng kém hơn
cường độ hô hấp làm tăng hàm lượng CO
2
gây độc cho cây.
Khi ánh sáng quá nhiều, cường độ ánh sáng tăng cao sẽ làm tăng sự thoát
hơi nước, làm cho môi trường nuôi cấy khô do thiếu nước ảnh hưởng tới sự
phát triển của mô cấy.
Ánh sáng trong phòng cấy mô có cường độ thay đổi trong khoảng 3000-
5.000lux thời gian chiếu sáng từ 8-10 giờ /ngày.

19
Khi chuẩn bị đưa cây ra vườn ươm thì cường độ ánh sáng tăng lên khoảng từ
3.000- 5.000 lux
Phản ứng của cây đối với quang hợp và phát sinh hình thái khi ánh sáng có
bước sóng 400 và 680nm do diệp lục tố a và b có hai cực đại hấp thu, một ở

pH phù hợp để mô có thể phát triển được.
1.6 Giai đoạn thích nghi:
Để thích nghi cây dừa nuôi cấy phôi, cây con cần có tỷ lệ thích hợp giữa
chồi và r
ễ. Nếu cây con đã được tạo rễ in vitro, khi trồng vào hỗn hợp đất (chứa
trong túi PE) cần được duy trì trong các điều kiện che sáng một phần và độ ẩm
tương đối cao trong vài ngày. Cây thích nghi nhờ sự giảm dần độ ẩm tương đối

20
trong khí quyển. Điều này được thực hiện đơn giản bằng cách trùm cây con với với
túi PE trong suốt trong vài ngày sau đó mở dần túi PE ra.
Cây con ra rễ in vitro có thể làm cho cứng cáp hơn bằng cách để cây con
trong ống nghệm thêm 1-2 tuần trước khi cho ra hỗn hợp đất.
Xử lý cây con mới được chuyển ra đất với các chất chống nấm giúp làm tăng
đáng kể sự sống còn của các cây con.
Sự tự dưỡng của cây con:
Quang hợp và sự tạo lớp sáp cutin trên lá có ảnh hưởng trên sự sống còn của
cây con từ sự nuôi cấy in vitro.
Cây con tăng tưởng in vitro trên môi trường giàu carbihydrate nói chung chỉ
sản xuất một phần rất ít nhu cầu carbohydrate từ sự cố định CO
2
trong quang hợp.
Khi các cây con này được chuyển vào điều kiện in vivo, chúng phải trở nên hoàn
toàn tự dưỡng, quang hợp gia tăng. Tuy nhiên trong thời gian đầu (trong vòng
khoảng 1-2 tuần) chúng vẫn còn phóng thích nhiều CO
2
hơn là hấp thu cho quang
hợp. Hô hấp tối của các cây này cũng cao hơn hô hấp tối của các cây con cùng
tuổi, cho thấy rằng các cây con mới được chuyển dùng nhiều năng lượng để thích
ứng với môi trường mới. Do đó sự sống còn của các cây con mới được chuyển ra

Khử trùng mẫu cấy
- Dừa sáp sau khi được mang về được lột bỏ lớp vỏ bên ngoài, bổ đôi quả
dừa.
-
Phôi được tách ra bằng dụng cụ lấy phôi.
- Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa mang đi rửa sạch,
ngâm trong xà phòng loãng khoảng 3-5 phút, rửa sạch lại dưới vòi nước
chảy.
Các bước khử trùng phôi dừa sáp trong tủ cấy vô trùng :
- Ngâm phôi dừa sáp trong cồn 96
0
trong vòng 1-2 phút.
- Ngâm trong javen 100% trong 10-15 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng khoảng 4-5 lần .
- Dùng dao cấy tách lấy phôi ra khỏi lớp cơm dừa.
- Ngâm phôi đã được tách vào javen 10% trong vòng 1-2 phút.
- Tiếp tục rửa lại phôi 3 lần bằng nước cất vô trùng.
- Phôi đã sẵn sàng cho các thí nghiệm nuôi cấy.
2.2.1 Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn
phòng thí nghiệm: nguồn carbon, nitơ, các chất
điều hòa tăng
trưởng thực vật để tăng tỷ lệ nảy mầm và sống của phôi dừa Sáp
Mục đích thí nghiệm: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy phôi để làm
tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong phòng thí
nghiệm, giúp phôi phát triển nhanh, cải thiện hệ thống chồi và rễ.

22
2.2.1.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi
trường nuôi cấy:
Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có hàm lượng N phù

hòa tăng trưởng thực vật thích hợp cho phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển
thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm, phôi phát triển nhanh, chồi và rễ
khỏe.
Thí nghiệm một yếu tố gồm 4 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy đủ
hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với 10 phôi/nghiệm thức.

23
Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều
hòa tăng trưởng thực vật đến sự nảy mầm và tăng trưởng của phôi
dừa Sáp
ST
T
Nghiệm thức Công thức
1 ST1 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L
2 ST2 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + NAA 1mg/L
3 ST3 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + GA 7mg/L
4 ST4 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + BA 5mg/L
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nảy mầm, tỉ lệ sống, chiều cao cây, chiều
dài rễ, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá.
- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy. Thí nghiệm được theo dõi
trong 3 tháng
2.2.1.3- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường (nguồn

phôi mới được cấy vào ống nghiệm, chúng tôi nhận thấy một số phôi bị
chìm hoàn toàn trong môi trường lỏng, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15%, điều
này làm hạn chế tỷ lệ nảy mầm và tăng trưởng của phôi.
Thí nghiệm được thực hiện nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấ
y (môi
trường lỏng lắc hay môi trường lỏng tĩnh kết hợp với nhiệt độ 25
o
C ± 2
o
C
và 30
o
C ± 2
o
C) giúp cải thiện tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây của
phôi dừa Sáp đặc biệt là đối với những phôi bị chìm hoàn toàn trong môi
trường nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy lỏng tĩnh: Sau khi được tách ra khỏi nội nhũ, các phôi
được cấy vào các bình tam giác 250ml có chứa 50ml môi trường lỏng Y3
căn bản và được đặt trên các kệ sáng cố định ở nhiệt độ 25
o
C ± 2
o
C và
30
o
C ± 2
o
C , cường độ ánh sáng khoảng 2000 lux, thời gian chiếu sáng
9h/ngày.

0
C ± 2
0
C