CÔNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN
VIỆN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN
QUÝ HIẾM CÂY THUỐC LÁ

Chủ trì nhiệm vụ: KS. Trần Thị Thanh Hảo 7722
26/02/2010 HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009


HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009
2
MỞ ĐẦU
Việt Nam được đánh giá là một trong 15 nước có nguồn tài nguyên di
truyền thực vật phong phú. Sự đa dạng, giàu có về tài nguyên di truyền thực vật
là tiền đề để nước ta phát triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên do sức ép gia
tăng dân số và sự thâm canh nông nghiệp không hợp lý, nguồn gen cây nông
nghiệp đã và đang bị xói mòn, mất mát với tốc độ rất nhanh. Từ một nước thiếu
lươ
ng thực, Việt Nam đã đảm bảo được an ninh lương thực, trở thành nước
xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới. Bên cạnh những thành công to lớn đạt
được, mặt trái của nó là sự mất dần đi nhiều giống lúa địa phương, những giống
lúa có chất lượng cao do áp dụng các giống cải tiến có năng suất cao. Điều này
cũng xảy ra với hầu hế
t các hoạt động gắn với tài nguyên nông nghiệp và lương
thực, thuỷ sản, lâm nghiệp. Theo PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trung tâm
Tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam thì có đến 80%
nguồn gen tại các địa phương đã không còn tồn tại ngoài sản xuất.
Trước thực trạng tài nguyên di truyền thực vật suy giảm, các nhà khoa
học khẳng định đã đến lúc cần chú trọng công tác bảo tồn, phát triển nguồ
n gen
tại cộng đồng bên cạnh bảo quản tại ngân hàng gen.
Tuy nhiên, do nhu cầu cuộc sống, người nông dân chỉ trồng những loại
cây mang lại lợi ích kinh tế hoặc có giá trị sử dụng. Vì thế, mà những nguồn
gen địa phương có chất lượng cao, thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng, có khả
năng chống chịu tốt, nhưng giá trị kinh tế thấp nên đã không được gieo trồng,
có nguy c
ơ biến mất. Bảo tồn thông qua sử dụng được coi là giải pháp tối ưu để
thúc đẩy sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN 9
1. Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc
tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống 9

1.1. Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại 9
1.2. Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá 10
1.2.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống 10
1.2.2. Một số chỉ tiêu sinh học của các dòng/giống 11
1.2.3. Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính 11
1.2.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống 12
1.2.5. Một số chỉ tiêu hoá học chính thuốc lá nguyên liệu 13
1.2.6. Chất lượng giống dựa vào tính chất hút 13
1.3. Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống 14
2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu 14
2.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp 15
2.2. Chọn lọc invitro sau biến nạp 15
2.3. Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1) 17
2.4. Giai đoạn trồng ra bầu đất 17
2.5. Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 17
3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm 18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 19
1. Kết luận 19
2. Kiến nghị 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO 21
PHỤ LỤC 22
4TÓM TẮT NHIỆM VỤ



5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cũng như
các cây trồng nông nghiệp khác bệnh và sâu hại luôn là mối đe dọa đến năng
suất và chất lượng nguyên liệu thuốc lá. Mức độ thiệt hại hàng năm tuỳ thuộc
vào từng vùng, từng bệnh mà biến động từ 0-100%, trung bình từ 20-30%. Theo
tổng kết của Shew và Luca, 1991 thiệt hại do sâu bệnh hại thuốc lá tạ
i Mỹ lên
tới 20% .
Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan
tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Chọn tạo giống
theo hướng chống chịu sâu bệnh là một trong những hướng chọn tạo giống
thuốc lá, chính vì vậy những nguồn vật liệu khởi đầu mang những đặc tính
chống chịu sâu bệnh cần được bảo tồn, khai thác và phát triển.
Biệ
n pháp chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh truyền thống gặp một số
khó khăn nhất định do tính trạng qui định đặc tính chống chịu sâu bệnh thường
do nhiều gen qui định hoặc gắn với một số tính trạng không tốt. Để nâng cao
hiệu quả trong chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh, việc ứng dụng công nghệ
biến đổi di truyền để chọn t
ạo giống kháng sâu bệnh hại chính đã và đang được
quan tâm nghiên cứu [1]. Gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vip
(vegetative insecticidal protein-protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho
các protein Vip trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt, có
hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao. Gen vip3 mã hoá các protein hoạt
động trong ruột giữa của côn trùng (gắn với chất nhận đặc hiệu, tạo thành các
kênh trao đổi ion gây nên sự mất cân bằng trao đổi chất, làm tê liệt bộ
máy tiêu

- Sản xuất hạt của một số dòng/giống thuốc lá mang đặc tính chống chịu
bệnh hại
- Ứng dụng kĩ nghệ di truyền (công nghệ sinh học) để tạo giống mang gen
chống chịu sâu (vip3A) trên cây thuốc lá
- Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm
2. Nội dung nghiên cứu
2.1. Nhân nhanh 04 dòng/giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang
các đặc tính ch
ống chịu bệnh hại để sản xuất hạt đầu dòng
2.2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu:
- Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá (giống K326) thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.tumerfaciens )
- Bước đầu kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào thông qua phản ứng
PCR với cặp mổi đặc hiệu.
2.3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong
ống nghiệm
3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy cây trong ống nghiệm theo Murashige & Skoog
1962.
- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng theo phương pháp khối ngẫu nhiên
hoàn chỉnh, nhắc lại 3 lần
- Số liệu được xử lý theo IRRISTART 5.0, phần mềm excel
- Phương pháp đánh giá chất lượng giống qua phân tích thành phần hoá
học nguyên liệu thuốc lá: đường khử (TCVN 7102:2002), đạm tổng số (TCVN
7252:2003), nicotin (TCVN 6679:2000), clo (TCVN 7251:2003)
- Đánh giá chất lượng giống qua bình hút cảm quan nguyên liệu theo TC
01-2000.
- Phân cấp thuốc lá nguyên liệu vàng sấy theo tiêu chuẩn TCN 26 -1 -02
- Kỹ thuật trồng và hái sấy thuốc lá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 618-
2005.

9
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN
1. Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc
tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống
1.1. Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại
Hàng năm Viện KTKT Thuốc lá đều tiến hành thu thập bổ sung các giống
thuốc lá vào trong tập đoàn quỹ gen. Trong quá trình thu thập, khảo sát và đánh
giá bước đầu thu được một số
đặc tính quý của một số giống. Trên cơ sở những
đặc tính mô tả ban đầu chúng tôi sắp xếp theo nhóm giống, lựa chọn một số
giống có những đặc tính tốt để tiếp tục đánh giá vào vụ sau.
Năm 2009, chúng tôi chọn lọc và đánh giá một số dòng, giống mang một số
đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại chính là dòng SG8, SG9, BS4 và giống
ChinKB
Bảng 1. Một số đặc điể
m quý của các dòng/giống thuốc lá
TT Dòng/giống Địa điểm /năm thu thập Đặc tính quý
1
Chin KB
Trung Quốc - 2006
Kháng bệnh đen thân, năng suất
cao
2
SG 8
Sài Gòn - 2007
Kháng bệnh héo đốm cà chua
(TSWV)
3
SG9
Sài Gòn - 2007

2 Môi trường khởi động (3 - 5tuần)
Chọn các mảnh lá phân hóa mạnh, sạch
cắt thành các cụm có kích thước 0,5 - 1cm
2

Môi trường nhân đa chồi (3- 4 tuần)
Chọn các chồi phân hóa rõ ràng
có chiều dài 1 - 2cm, có 1 - 2 lá thật
Môi trường ra rễ (3 - 4 tuần)
Chọn những cây có bộ rễ phát triển đầy đủ
có 3 - 5 lá thật, cao khoảng 3- 5 cm
Ra cây và vào bầu (3- 4 tuần)

Trồng ra ruộng
Năm 2009 các dòng/giống được nhân invitro để đánh giá lại một số đặc tính
quý và chọn cá thể tốt để thu hạt. Một số đặc điểm chính của các dòng/gi
ống được
thu thập thể hiện trong các bảng biểu dưới đây.
1.2. Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá
1.2.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống
Thời gian sinh trưởng của các giống giúp người sản xuất chủ động bố trí
sắp xếp thời gian trồng và bố trí thời vụ hợp lý.
Bảng 2. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống
ĐVT:ngày
TT Tên dòng/
giống
T

Số lá và kích thước lá là những yếu tố liên quan chặt chẽ đến tiềm năng
năng suất của các giống. Những giống có số lá sinh học cao (SLSH), kích thước
lá lớn sẽ cho tiềm năng năng suất cao.
Bảng 3. Một số chỉ tiêu sinh học về thân và lá của các dòng/giống

KTL (cm)
TT
Tên
dòng/giống
CCSH
(cm)
φ thân*
(cm)
Độ dài
lóng
(cm)
Tổng
số lá
(lá)
SLKT
(lá)
Dài Rộng
1 Chin KB 145,6 2,9 5,2 22,5 17,3 65,1 28,3
2 SG8 149,3 2,9 4,9 22,2 16,9 63,4 23,4
3 SG9 150,1 2,8 4,9 23,2 17,6 65,7 24,5
4 BS4 150,3 2,7 4,7 24,2 19,1 62,1 23,8
5 K326 đ/c 140,7 2,8 5,6 23,7 18,4 62,5 26,0
LSD
5%
4,02 0,84

Ghi chú: - Không bị bệnh +: Nhiễm bệnh nhẹ (TLB<10% )
++: Nhiễm bệnh trung bình (TLB: 10 - 20%) ; +++: Nhiễm bệnh nặng (TLB >20% )
1.2.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống
Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống được thể
hiện trong bảng 5.
Bảng 5. Năng suất và phẩm cấp của các dòng/giống
TT
Tên
dòng/giống
KLTB
lá tươi
(g)
Tỷ lệ
tươi/ khô
Tỷ lệ
cấp 1+2
(%)
Tỷ
lệ
cọng
(%)
NS thực
thu
(tạ/ha)
1 Chin KB 62,7 8,3 23,7 32,0 20,1
2 SG8 54,0 7,9 17,6 33,5 15,9
3 SG9 56,3 8,0 25,5 30,5 16,8
4 BS4 50,4 9,0 11,8 38,0 17,8
5 K326 đ/c 56,9 7,5 30,0 36,5 20,9
LSD

Bảng 7. Chất lượng các dòng/giống qua bình hút cảm quan
ĐVT: Điểm
TT
Tên
dòng/giống
Hương Vị
Độ
nặng
Độ
cháy
Màu
sắc
Tổng
điểm
1 Chin KB 9,3 9,2 7,0 6,0 6,0 37,5
2 SG8 9,6 9,6 6,5 6,0 6,0 37,7
3 SG9 9,2 9,4 6,4 6,0 6,0 37,0
4 BS4 9,5 9,6 6,9 6,0 6,0 38,0
5 K326 đ/c 9,5 9,5 6,5 6,0 6,0 37,5
Các dòng/giống đều có hương và vị khá (9,2 - 9,6 điểm), độ nặng vừa
phải (6,4 - 7 điểm), độ cháy khá (6 điểm), màu sắc từ vàng cam tới vàng sáng,
tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm), đáp ứng chất lượng nguyên liệu trong
nước.
14
1.3. Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống
Tiến hành chọn những cá thể có kiểu hình tương đối đồng đều trong suốt
quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngoài đồng ruộng, bao hoa và thu hạt
giống của các dòng/giống. Kết quả được thể hiện trong bảng 8.
Bảng 8. Kết quả chọn lọc và lượng hạt của các dòng/giống
TT Dòng/giống

có tác dụng .
Gen vip3A sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên
cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen
được chèn vào vector chuyển gen th
ực vật pBI121 dưới sự điều khiển của
promotor 35S và được biến nạp vào vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58.
15
Sơ đồ 2. Quá trình biến nạp gen
vip3A
vào thuốc lá và sàng lọc cây sau biến nạp 2.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp
Dòng khuẩn lạc A.tumerfaciens chủng C58 mang gen vip3A được nuôi hồi
phục trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc. Sau đó chọn một dòng
khuẩn lạc tròn, độc lập trên LB đặc cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa
kháng sinh chọn lọc để để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen.
Dịch huyền phù vi khuẩn đươc đo bằng phương pháp đo giá trị mật độ quang

Mảnh lá Cụm chồi Ra rễ (lần 1) Ra rễ (lần 2)
CTTN 77,7 82,3 73,3 81,8
Đ/C1 0,0 0,0 0,0 0,0
Đ/C2 93,3 96,7 96,7 96,6
LSD
5%
6,9 3,4 4,6 4,9
Ghi chú: CTTN: công thức thí nghiệm; Đ/C1: mẫu không chuyển gen trên môi trường
có chứa kháng sinh chọn lọc Kan; Đ/C2: mẫu không chuyển gen trên môi trường không chứa
kháng sinh chọn lọc Kan
.
Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi
Ở CTTN, số mảnh lá tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc GM Kan
30 khá cao (77,7%). Theo lý thuyết những dòng tái sinh được trên môi trường
có kháng sinh Kan là do trong genom của chúng có mang gen kháng Kan nên
có thể kết luận đây là những mẫu đã biến nạp thành công, trong khi ở Đ/C1 các
mảnh lá không tái sinh đa chồi, vàng dần và chết chứng tỏ trong tế bào của các
mảnh lá không biến nạp không chứa gen kháng Kan nên chúng không thể tái
sinh trên môi trường có kháng sinh này.
Đ/C 2 có tỷ lệ mẫu phân hóa thành
cụm chồi trên môi trường GM là 93,3%.
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau biến nạp:
Những cụm chồi ở CTTN được cắt nhỏ và chuyển sang môi trường tái
sinh đa chồi GM Kan 50 để tiếp tục chọn lọc, những cụm chồi ở Đ/C2 được
dùng làm vật liệu cho Đ/C 1 và Đ/C 2 ở giai đoạn chọn lọc cụm chồi.
Số cụm chồi tiếp tục phân hoá trên môi trường chọn lọc (GM Kan 50) đạt
82,3%, các cụm chồi còn lại phân hoá chậm và vàng dần, trong khi Đ/C1 100%
các cụm chồi phân hóa chậm hoặc ngừng phân hoá ,vàng dần và chết, Đ/C2 có
tỷ lệ mẫu tái sinh trên môi trường là 96,7%.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh:

dưỡng. Sau 14 ngày chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đặt
trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất đạt 90 %
(tương đương với Đ/C) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoạ
i cảnh.
Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái
sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn
thành
2.5. Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen
Vào giai đoạn 30 ngày sau trồng, khi cây đã mọc ra lá mới và phát triển
bình thường thì tiến hành thu mẫu lá non của 16 dòng thuốc lá chuyển gen để
tách chiết DNA tổng số. Các mẫu DNA được kiểm tra với cặp mồi 35S Fs/Rs để
xác định xem gen
được chuyển vào có tiếp tục phiên mã và hoạt động trong cây
hay không bằng phản ứng PCR . PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn
nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp
thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo
lý thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen
nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển
gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó
đã mang đoạn gen cần chuyển [1], [2].
Promotor 35S được thiết kế trong cấu trúc vector pBI121, nằm trong phần
bờ trái và bờ phải của cấu trúc chứa đoạn gen chuyển vào cây, có tác dụng tăng
cường quá trình phiên mã của gen được chuyển vào. Cặp mồi 35S Fs/Rs được
18
thiết kế để nhân đoạn gen có kích thước 314 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR
của 16 dòng thuốc lá chuyển gen được thể hiện trong hình 1 Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs
M: marker; 1-16: các dòng thuốc lá chuyển gen

4 BS4 Kháng bệnh khảm lá (TMV và CMV) Cây invitro và hạt
5 K326 - v1 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o
6 K326 - v2 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

7 K326 - v3 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

8 K326 - v4 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

9 K326 - v5 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

10 K326 - v6 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

11 K326 - v7 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

12 K326 - v8 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

13 K326 - v9 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o

14 K326 - v10 Mang gen kháng sâu (vip3A) Cây invitro thế hệ T
o


bình, năng suất tương đương giống đối chứng K326. Dòng SG 8 và SG9 có hàm
lượ
ng nicotin cao hơn đối chứng, năng suất thực thu tương đương nhau và thấp
hơn giống đối chứng. Riêng dòng BS4 có tỷ lệ tươi/khô cao, tỷ lệ cấp 1+2 thấp,
có tỷ lệ cọng cao, năng suất và hàm lượng đường khử thấp so với đ/c. Các
dòng/giống đều có hương và vị khá, độ nặng vừa phải, độ cháy khá, màu sắc từ
vàng cam tới vàng sáng, tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm)
Chọn lọc những cá thể sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều để thu hạt giống.
Lượng hạt giống thu được từ 100 -150g dòng/giống, đạt yêu cầu về chất lượng
hạt nguyên chủng (khối lượng 1000 hạt trên 80 mg, tỷ lệ nảy mầm trên 85%).
1.2. Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu
Chuyển thành công gen kháng sâu vip3A dưới sự điều khiể
n của promotor 35S
vào 16 dòng thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58
Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong 16 dòng thuốc lá chuyển gen
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu là 35S Fs/Rs cho thấy toàn bộ 16 dòng
thuốc lá chuyển gen (100%) đều cho một băng có kích thước khoảng 300 bp,
chứng tỏ sự có mặt của gen được chuyển vào 16 dòng thuốc lá chuyển gen.
1.3. Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm
20 dòng/giống mang nguồ
n gen quí được thường xuyên cấy chuyển sang môi
trường mới, Nguồn hạt giống được bảo quản trong kho lạnh đảm bảo các
dòng/giống sinh trưởng phát triển tốt.
2. Kiến nghị
- Đề nghị Hội đồng KHKT Bộ CN nghiệm thu nhiệm vụ năm 2009 và cho phép
tiếp tục thực hiện nhiệm vụ trong những năm tiếp theo

Hà Nội, ngày tháng năm
Xác nhận của đơn v
ị chủ trì Chủ nhiệm đề tài

The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses
midgut epithelium cells of susceptible insects. Applied and
Environmental Microbiology 63:532-536; 1997
22

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Phụ lục 2: Cấu trúc vector pBI121
Phụ lục 3: Trình tự gen vip3A
Phụ lục 4: Phương pháp chuyển gen quan tâm vào cây thuốc lá (cải tiến)
(Topping, 1998)
Phụ lục 5a: Kết quả xử lý số liệu ngoài đồng ruộng
Phụ lục 5b: Kết quả xử lý số liệu trong phòng thí nghiệm
Phụ lục 6: Các hồ sơ liên quan đến nhiệm vụ
Quyết định giao nhiệm vụ

Hợp đồng
Thuyết minh
Biên bản nghiệm thu cấp cơ sở
Bài phản biện của Hội đồng cấp cơ sở
H
3
BO
3
6,2
MnSO
4
22,3
ZnSO
4
8,6
KI 0,83
Na
2
MoO
4
0,25
CuSO
4
0,025
CoCl
2
0,025
Na
2
EDTA 37,3
Trung và Vi lượng
FeSO
4
.7H

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus;
Bacillus cereus group.
REFERENCE 1
AUTHORS Pham,N.B., Le,N.H., Pham,T.T., Chu,H.H. and Le,B.T.
TITLE Cloning and sequence analysis gene encoding the vegetative
insecticidal protein (VIP3A) of some Vietnamese B.
thuringiensis strains
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 2370)
AUTHORS Pham,N.B.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-MAY-2005) Pham N.B., Plant Cell Technology,
Institute of Biotechnology (IBT), Hoang Quoc Viet Str. 18, Cau Giay,
Hanoi,10000, VIET NAM
FEATURES Location/Qualifiers
source 1 2370
/organism="Bacillus thuringiensis"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="BTAB51"
/db_xref="taxon:1428
"
/country="Viet Nam"
gene
1 2370