Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm tạ và biết ơn:
Thầy Nguyễn Văn Nguyện và Anh Giáp Văn Thắng đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành tốt luận
văn này.
Quý Thầy cô trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ đã giảng dạy và truyền đạt
những kiến thức cho tôi trong suốt khoảng thời gian học tại trường.
Quý Thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến
thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm trong cuộc sống sản xuất thực tế.
Các anh chị, cán bộ phòng thí nghiệm – cán bộ thư viện cùng tất cả các bạn sinh
viên trong và ngoài ngành Công nghệ Thực Phẩm đã trau dồi, giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu đề tài.
Một lần nữa xin chân thành cảm tạ và biết ơn.
TPHCM, ngày 22 tháng 9 năm
2008
Sinh viên
Huỳnh Thị Quỳnh Ngân
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong quá trình nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn thừa và chất thải hữu cơ thải ra môi
trường nuôi khá lớn. Các hợp chất hữu cơ này là nhân tố kích thích sự phát triển của VSV gây
ô nhiễm ao nuôi làm mất cân bằng hệ sinh thái ao. Mặt khác, trong quá trình phân hủy không
triệt để các hợp chất hữu cơ từ thức ăn thừa, chất thải và xác động vật nuôi sinh ra một số chất
độc. Một số hợp chất độc (NH
3
, H
2
S, CH
4

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy tăng sinh cho chủng Bacillus subtilis.
- Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng
Bacillus subtilis như nhiệt độ, pH môi trường.
- Nghiên cứu các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ và muối khoáng.
- Nghiên cứu khả năng tạo bào tử Bacillus subtilis.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến tốc độ sinh trưởng cho chủng Bacillus
subtilis.
- Xây dựng quy trình thu nhận sinh khối Bacillus subtilis.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 3
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghề nuôi thủy sản ở khu vực ĐBSCL
Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đã đạt được những thành
tựu to lớn, đóng góp đáng kể cho sự phát triển
ngành thuỷ sản nói riêng và cho nền kinh tế quốc
dân nói chung. Trong các hoạt động hỗ trợ cho sự
phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản, chế biến
thức ăn, sản xuất giống thuỷ sản, thú y và đặc biệt
là công tác phát triển hệ thống thuỷ lợi là không thể
không nhắc đến.
Như chúng ta đã biết, hoạt động NTTS của Việt
Nam chủ yếu được tiến hành ở vùng ĐBSCL - là
vùng chiếm phần lớn cả về sản lượng và diện tích NTTS của cả nước với tổng diện tích có
khả năng phát triển NTTS toàn vùng khoảng 1.377.800 ha và diện tích hiện đã đưa vào phát
triển NTTS (2005) là 709.980 ha, tổng sản lượng NTTS (2005) đạt 1.014.590 tấn chiếm tới
72% tổng sản lượng NTTS toàn quốc. Dự tính đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi
thủy sản nước mặn-lợ là 649.430 ha, nuôi trồng thủy sản nước ngọt là 366.590 ha [13]. Với
hiện trạng phát triển như vậy hoạt động NTTS vùng ĐBSCL cũng cần có các đầu vào tương
ứng bao gồm cả con giống, thức ăn và đặc biệt là nguồn cấp và thoát nước thích hợp. Điều
này cho thấy nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế -

ra ngoài không chỉ gây dịch bệnh cho vật nuôi mà còn tác động tới sức khỏe của con người
qua nguồn nước sinh hoạt. Bên cạnh đó hệ thống thủy lợi phục vụ nuôi thủy sản chưa bảo
đảm không tuân thủ các qui định về bảo vệ môi trường như xây dựng hệ thống xử lý nước
cấp, nước thải, chất thải từ ao nuôi, không đảm bảo điều kiện vệ sinh thú y trong nuôi trồng
thủy sản, không xây dựng hệ thống ao lắng để xử lý nước trước khi cho vào ao nuôi và xử lý
nước thải trước khi xả ra sông rạch. Điển hình là ở những khu vực nuôi cá tra hầm nổi tiếng
dọc bờ sông Tiền, sông Hậu các chủ ao đầm xả nước thải ô nhiễm và bùn đáy ao ra sông rồi
lại bơm trực tiếp nguồn nước ô nhiễm đó vào lại ao nuôi cá [8].
Đứng trước những vấn đề ô nhiễm môi trường do nuôi trồng thủy sản gây ra như hiện nay,
cần phải có những biện pháp hữu hiệu để khắc phục nhằm đem lại nguồn nước sạch hơn cho
vật nuôi lẫn con người.
1.2.3. Giải pháp khắc phục
Ðể bảo đảm phát triển lợi thế ngành nuôi trồng thủy sản ở ÐBSCL nhằm đáp ứng yêu cầu
hội nhập quốc tế, cần phải thực hiện các biện pháp thích hợp để giải quyết những khó khăn về
ô nhiễm. Hiện nay, có một số biện pháp nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước nuôi thủy
sản đang được áp dụng như giải pháp về cơ học, hóa học và sinh học.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 5
Hình 1.2 Ô nhiễm môi trường ao
nuôi cá [16].
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
1.2.3.1. Giải pháp cơ học
Giải pháp thường dùng hiện nay là dùng bơm để hút hết nước trong ao hoặc rải vôi trên
khắp mặt ao hoặc dùng các hệ thống tái tuần hoàn nước. Hệ thống này được phát triển ở nhiều
nơi chủ yếu để loại bỏ các tác nhân gây bệnh do virút trong các hệ thống nuôi. Chúng mang
lại một số hiệu quả nhất định trong việc giảm lượng nước thải ra môi trường do lượng nước
thải vào các thuỷ vực lân cận giảm đi đáng kể [7]. Ngoài ra, các hệ thống khép kín này giúp
người NTTS ngăn ngừa các chất độc hại do các tác nhân gây bệnh, thuốc trừ sâu và thuốc diệt
cỏ. Hệ thống tái tuần hoàn có thể được dùng để tăng cường việc diệt vi khuẩn, giúp loại bỏ
các chất hữu cơ lơ lửng là những chất có thể chứa các tác nhân gây bệnh hay dư lượng hoá
chất. Tuy nhiên giải pháp cơ học để hút chất thải ra ngoài đòi hỏi đầu tư rất lớn về chi phí vận

Như vậy, để khắc phục các vấn đề trong xử lý nước ao nuôi thủy sản mà không ảnh
hưởng xấu đến chất lượng giống cũng như các giai đoạn trong quá trình nuôi thì việc chọn
giải pháp để khắc phục là cần thiết. Trong các giải pháp đang được áp dụng hiện nay, phương
pháp sinh học được quan tâm nhiều nhất, cho hiệu quả xử lý ô nhiễm cao và thân thiện với
môi trường. Do phương pháp này chiếm vai trò quan trọng về qui mô cũng như giá thành đầu
tư, chi phí cho một đơn vị khối lượng chất khử là ít nhất. Đặc biệt xử lí nước thải bằng biện
pháp sinh học sẽ không gây ô nhiễm, tái ô nhiễm môi trường.
1.3. Một số nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV
1.3.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon của vi sinh vật
Nguồn cacbon có vai trò quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV. Chúng vừa
là nguồn năng lượng vừa là nguồn dinh dưỡng cho cơ thể. Mỗi loài VSV đều thích hợp với
các nguồn cacbon khác nhau. Do đó, căn cứ vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia
vi sinh vật thành các nhóm khác nhau (bảng 1.1).
Như vậy, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
,
NaHCO
3
, CaCO
3
) hoặc chất hữu cơ.
Trong tất cả các nguồn cacbon đơn giản và tổng hợp được dùng làm nguồn dinh dưỡng
cho VSV thì một số nguồn cacbon thay thế như rỉ đường, dịch kiềm sunfit, tinh bột và
cellulose, dầu thực vật…vv được sử dụng phổ biến trong công nghệ lên men.
Bảng 1.1 Thành phần nhóm vi sinh vật [5]
Nhóm sinh Tự dưỡng Dị dưỡng Hoại sinh Ký sinh
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
lý VSV
Tự dưỡng

chất nguyên
sinh các xác
hữu cơ.
Lấy từ các tổ
chức hoặc
dịch thể của
một cơ thể
sống.
Ví dụ về
VSV
Vi khuẩn có
sắc tố màu
đỏ
Vi khuẩn
nitrate, lưu
huỳnh vô
màu, vi
khuẩn sắt.
Vi khuẩn
lưu huỳnh
màu tía.
Động vật
nguyên
sinh, nấm,
một số vi
khuẩn.
Nấm, vi
khuẩn gây
thối, lên
men.

nguyên liệu này trước khi sử dụng làm môi trường nuôi cấy phải qua khâu xử lý và đường
hóa. Tuy nhiên đối với các chủng vi sinh vật có hệ enzym amylase phát triển, người ta có thể
sử dụng trực tiếp tinh bột sống không qua khâu đường hóa để nuôi cấy vi sinh vật. Thành
phần của chúng được nêu ở bảng 1.3.
Đối với cellulose người ta thường sử dụng dưới dạng rơm, rạ, giấy…Cấu tạo và tính chất
của chúng rất đặc biệt và phức tạp nhằm tạo ra sự vững chắc cho cellulose. Do đó, việc phân
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 9
Thành phần Tỷ lệ
Rỉ đường củ cải
(saccharose)
Rỉ đường mía
(saccharose)
Đường tổng số % 48 - 52 48 - 56
Chất hữu cơ khác % 12 - 17 9 - 12
Protein (N x 6,25) % 6 - 10 2 - 4
Kali % 2,0 - 7,0 1,5 - 5,0
Canxi % 0,1 - 0,5 0,4 - 0,8
Magie % 0,09 0,06
Photpho % 0,02 - 0,07 0,6 - 2,0
Biotin mg/kg 0,02 - 0,15 1,0 - 3,0
Axit pantotenic mg/kg 50 - 110 15 -55
Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500 - 6000
Tiamin mg/kg 1,3 1,8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
hủy chúng trở nên rất khó khăn. Tuy vậy, cellulose cũng bị phân hủy bởi VSV trong những
điều kiện thích hợp và sự phân hủy này đòi hỏi cần có nhiều loại enzyme khác nhau.
1.3.1.3. Dịch kiềm sulfite
Là một loại phế phẩm của công nghiệp sản xuất cellulose. Chúng có đặc tính hấp thụ nhiều
oxy, cho nên khi nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so
với mức bình thường. Thành phần của chúng gồm 80% chất khô là đường hexose (glucose,

1.3.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ của vi sinh vật
Nitơ tham gia vào thành phần của rất nhiều vật chất có trong tế bào như protein, enzyme,
axit nucleic. Đặc biệt chúng có nhiều trong protein. Chúng thường tồn tại ở dạng nitơ hữu cơ
và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ protein này thường có phân tử lượng lớn, rất khó xâm nhập vào
tế bào của VSV. Muốn sử dụng được nguồn nitơ này các VSV phải phân giải chúng thành
axitamin. Do đó, trong tế bào nitơ tham gia vào thành phần cấu trúc tạo nên tế bào của vi sinh
vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Một số nguồn nitơ hữu
cơ và vô cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy VSV được trình bày ở bảng 1.4.
Bảng 1.4 Một số nguồn nitơ trong nuôi cấy VSV [5]
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 12
Nguồn nitơ Đặc điểm
Urê Là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, bị
phân giải bởi enzim ureaza giải phóng NH
3
và CO
2
.
NH
2
- CO - NH
2
+ H
2
O → 2NH
3
+ CO
2
. Tan nhiều

dạng các muối sunphat, photphat, cacbonat, clorua Trong tế bào chúng thường ở dạng các
ion. Dạng cation chẳng hạn như Mg
2+
, Ca
2+
, K
+
, Na
+
Dạng anion chẳng hạn như: HPO
4
2−
,
SO
4
2−
, HCO
3
−
, Cl
-

Hàm lượng các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất vi sinh vật thường thay đổi tùy
loài, tùy giai đoạn phát triển và tuỳ điều kiện nuôi cấy.
Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với tùy loài, tùy giai đoạn phát triển.
Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn
thường thay đổi trong các phạm vi được thể hiện ở bảng 1.6. Sự sinh trưởng và phát triển của
VSV sẽ không mạnh và nhanh nếu thiếu sự có mặt của một số nguồn khoáng như [3]:
phospho, canxi, kali, natri và clo. Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phospho
hơn bởi chúng không những có mặt trong nhiều thành phần quan trọng của tế bào mà phospho

2
O 0,1 - 0,2 0,2 - 0,5
MnSO
4
. 4H
2
O 0,005 - 0,01 0,02 - 0,1
FeSO
4
. 7H
2
O 0,005 - 0,01 0,05 - 0,02
Na
2
MO
4
0,001 - 0,05 0,01 - 0,02
ZnSO
4
. 7H
2
O - 0,02 - 0,1
CoCl
2
≤ 0,03 ≤ 0,06
CaCl
2
0,01 - 0,03 0,02 - 0,1
CaSO
4

SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 16
STT Nhóm vi sinh vật Nhiệt độ tối thiểu Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối đa
1 Ưa nóng 45
0
C - 40 55 - 75
0
C
60 - 70
0
C
2 Ưa ấm 15
0
C - 5
30 - 40
0
C 40 - 47
0
C
3 Ưa lạnh - - -
3.1 Ưa lạnh bắt buộc 5
0
C - (-5)
12 - 15
0
C 15 - 20
0
C
3.2 Ưa lạnh không bắt buộc 5
0
C - (-5)

+
và các
men chứa trong màng tế bào chất và tế bào.
Cũng giống như ở nhiệt độ, mỗi loài VSV cũng thích nghi với một loại pH môi trường
khác nhau (được thể hiện ở bảng 1.8). Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển
trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi
trường axit yếu. Nếu nồng độ hydro trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi
sinh vật nào đó thì sự sống bị ức chế. Thí dụ như trong quá trình làm dưa chua, độ axit dần
dần tăng lên làm tiêu diệt những vi khuẩn gây thối, sau đó là những vi khuẩn lactic. Sự thay
đổi pH môi trường có thể gây ra thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men. Trong điều kiện
phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường có pH đối với vi khuẩn 7,0 -
7,6; đối với nấm men và nấm mốc 3,0 - 6,0.
1.4.3. Ảnh hưởng của hoạt độ nước
Nước chiếm đến 70 - 90% khối luợng cơ thể sinh vật. Có vai trò khá quan trọng đối với sự
sinh trưởng và phát triển của VSV. Vì tất cả các phản ứng xảy ra và các hoạt động sống trong
tế bào vi sinh vật đều đòi hỏi có sự tồn tại của nước. Khi thiếu nước sẽ xảy ra hiện tượng loại
nước ra khỏi tế bào VSV, trao đổi chất bị giảm và tế bào chết. Đa số nước trong tế bào vi sinh
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
vật tồn tại ở dạng nước tự do, dễ hấp thụ. Ở vi khuẩn lượng nước chứa thường là 70 - 85%, ở
nấm sợi thường là 85 - 90%.
Yêu cầu của vi sinh vật đối với nước được biểu thị một cách định lượng bằng độ hoạt động
của nước (a
w
) trong môi trường. Độ hoạt động của nước còn được gọi là thế năng của nước
(p
w
):
Ở đây :
ρ là áp lực hơi của dung dịch

w
thấp nhất đối với một số vi sinh vật [3].
STT Nhóm vi sinh vật a
w
thấp nhất
1 Phần lớn vi khuẩn gram (-) 0,97
2 Phần lớn vi khuẩn gram (+) 0,90
3 Phần lớn nấm men 0,88
4 Phần lớn nấm sợi 0,80
5 Vi khuẩn ưa mặn 0,75
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 18
a
w
=ρ/ρ
0
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Bảng 1.8. Ảnh hưởng pH đối với một số vi sinh vật [3].
1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ oxy và nitơ
Nồng độ oxy và nitơ của môi trường có thể kích thích hay ức chế hoạt động sống của
VSV. Hầu hết các sinh vật hiếu khí bắt buộc phát triển ở thế oxy hóa - khử cao. Chúng có hệ
enzym hô hấp đầy đủ để tiến hành quá trình oxy hóa, dùng oxy làm chất nhận H
2
cuối cùng
được thể hiện rõ ở các phản ứng dưới đây:
O
2
+ e
-
→ O
2

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
H
2
O
2
+ e
-
+ H
+
→ H
2
O +OH ⋅
Vì vậy oxy trong môi trường làm cho hoạt động của chúng được tăng cường. Nồng độ oxy
quá cao sẽ bất lợi cho sự sinh sản của các VSV hiếu khí bắt buộc này. Còn đối với kỵ khí
không có hệ enzym hô hấp nên không sử dụng được oxy làm chất nhận H
2
. Kị khí bắt buộc
không sinh năng lượng trong suốt quá trình hô hấp và thường sử dụng quá trình lên men hoặc
hô hấp hiếu khí trong mục đích này. Do đó, nguồn oxy đôi khi quan trọng đối với chủng VSV
này nhưng không quan trọng đối với chủng VSV khác.
Những sản phẩm khử oxy là những độc tố lớn bởi vì những tác nhân oxy hóa mạnh và hủy
hoại một cách nhanh chóng những thành phần tế bào. Những thể thực bào lớn và trung tính
dùng sản phẩm khử oxy để lấn chiếm và hủy hoại mầm bệnh. Hiếu khí bắt buộc và kị khí
không bắt buộc thường chứa enzym SOD (superoxide dismutase) và enzym catalase, là
enzym phá hủy gốc superoxide và hydrogen peroxide. Peroxidase cũng có thể được dùng để
phá hủy hydrogen peroxide và các phản ứng sau chứng minh điều đó:
2O
2
-
⋅ + 2H

các chủng Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ, như protein khá
mạnh nhờ sinh ra protein ngoại bào. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh ra amylase làm
loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan [6].
1.5.1.1 Đặc điểm hình thái
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 20
Superoxide disutase
catalase
Peroxide
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Bacillus Subtilis được tìm thấy vào năm 1835 bởi ông Christian Gottfried Ehrenberg và
được mô tả bởi con Vibrio subtilis [10].
. Bacillus subtilis phân bố khắp mọi nơi và được phân lập từ đất, cỏ khô, rơm khô, nước
và không khí. Chúng cư ngụ ở những vùng rễ và lớp bề mặt của nền đất [10].
Bacillus Subtilis là trực khuẩn Gram dương. Trực khuẩn ngắn, nhỏ kích thước thay đổi
trong khoảng chiều rộng 0,5-1,0µm và chiều dài 1,0-4,0µm [10], nhiều khi nối lại thành
sợi dài, ngắn khác nhau và có thể đứng riêng rẽ. Chúng có hình que thẳng hoặc gần thẳng,
có tiêu mao và có khả năng sinh bào tử [6]. Hình que của Bacillus subtilis có chiều dài
khoảng 2-3µm và chiều cao khoảng 0.6µm được thể hiện ở hình 1.2. Đặc trưng của họ
này là sự hình thành nội bào tử, chỉ có một bào tử trong một tế bào. Sự hình thành bào tử
không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí. Gram dương hoặc chỉ cho Gram dương ở
giai đoạn đầu phát triển.
2.
3.
4.
5.
Giống như các trực khuẩn của loài Bacillus, Bacillus subtilis phát triển ở điều kiện hiếu
khí và có khả năng hình thành nên sự dẻo chắc, bảo vệ nội bào tử [3]. Đồng thời, nhằm kháng
lại các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ và sự thiếu hụt chất dinh dưỡng [3]. Do chúng
hiếu khí nên tương đối dễ thích nghi với điều kiện nuôi cấy trong môi trường lỏng.
Chúng có khuẩn lạc khô, vô màu hay có xám nhạt, trắng, hơi nhăn, hay tạo ra lớp màng

Bacillus pumilus
Bacillus megaterium
1.5.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng, có khả năng hô hấp trong khi sử dụng
nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ). Nên chúng thường làm thối
rữa hầu hết các cơ chất lấy được có nguồn gốc động vật và thực vật như cellulose, tinh bột,
pectin, agar, protein, hydrocacbon và các chất khác [3]. Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình,
khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25
0
C – 75
0
C, nhiệt độ tối ưu
là 30
0
C – 45
0
C, pH tối thiểu cho sự phát triển từ 7,5 – 8 [3]. Trong điều kiện môi trường nuôi
cấy đầy đủ chất dinh dưỡng và trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào vi sinh vật tăng
nhanh về kích thước đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
Các vi sinh vật sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn
sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi
cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc
nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào già chỉ được phát hiện trong trường hợp môi
trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật không có khả năng sinh sản nữa.
1.5.3. Cấu tạo của Bacillus
1.5.3.1. Màng S
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 22
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện
Màng ngoài protein hay tiểu phần glyprotein trong suốt gọi là lớp màng S, có ở các loài
Bacillus. Giống như các vi khuẩn khác chức năng của chúng vẫn chưa được biết.

+ Vỏ bào tử
+ Lõi bào tử: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và nhân.
1.5.4. Một số ứng dụng của Bacillus subtilis trong xử lý ô nhiễm môi trường nuôi trồng
thủy sản
Trong thủy sản, Bacillus có tác dụng làm giảm hàm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay
nước và cải thiện môi trường ( tăng oxy hòa tan, giảm BOD, COD) do có chức năng phân hủy
hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và phế thải nhờ khả năng tổng hợp enzym phân hủy
hữu cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm
số lượng VSV gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio spp, Aeromonas spp…Ngoài ra, chúng
còn có tác dụng đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của ngư
trường như B.subtilis, B.megaterium, B.licheniformis [12].
1.6. Quy trình thu nhận sinh khối của vi khuẩn
Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn hầu như không khác nhau [hình vẽ 1.5].
Hiện nay, quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn trải qua các bước như sau:
- Về giống vi sinh vật: Sau khi được bảo quản trong tủ lạnh, chúng được hoạt hóa và cấy
chuyền qua môi trường thạch nghiêng nhằm giữ giống cho các thí nghiệm sau này.
- Cấy chuyền: Chuyển giống vào môi trường lỏng và nuôi chúng theo phương pháp nuôi
trên máy lắc (với tần số lắc là 100 – 200v/ph ở nhiệt độ 30
0
C ± 2, nuôi trong 18 – 20h) hoặc
nuôi trên môi trường rắn (môi trường sau khi trộn giống được trải ra khay với chiều dày môi
trường là 3 -5cm. Nuôi trong điều kiện vô trùng, ở nhiệt độ 28 – 32
0
C trong thời gian 24 –
36h). Môi trường lỏng nuôi cấy bao gồm nhiều môi trường. Điều chỉnh môi trường lỏng nằm
trong khoảng pH = 6.5 – 7.2. Môi trường phải được thanh trùng và làm nguội trước khi cấy
giống VSV vào.
- Lên men: Sau khi chuẩn bị giống và môi trường đầy đủ chuyển lên thiết bị lên men và
giống được nuôi trong các môi trường có thành phần dinh dưỡng tối ưu.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 24