i
LI CAM OAN
Tụi xin cam ủoan ủõy l ủ ti nghiờn cu ca tụi. Cỏc kt qu nghiờn cu
trong lun vn l trung thc v cha ủc ai cụng b trong bt kỡ cụng trỡnh
no khỏc. Mi s giỳp ủ v cỏc thụng tin trớch dn ủó ủc nờu rừ ngun
gc. Ngi thc hin
Tửụỷng Ngoùc Thuùc Uyeõn LUN VN THC S SINH HC
BUễN MA THUT, NM 2010
ii
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
-PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người hướng dẫn khoa học trực tiếp, ñã
tận tình hướng dẫn phương pháp nghiên cứu và ñóng góp nhiều ý kiến quý
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………… i
LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………… ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………… vi
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH x
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1.Tính cấp thiết 1
1.2. Mục tiêu ñề tài 2
1.3.Ý nghĩa khoa học 3
1.4.Ý nghĩa thực tiễn 3
1.5.Giới hạn ñề tài 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4
2.1. Tổng quan về chitosan ………………………………………………. 4
2.2. Tổng quan về nano chitosan 6
2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan 6
2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học 14
2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư 16
2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) 17
2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa 17
2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) 18
ñiện thế hạt nano chitosan 56
4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62
4 2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả
năng kháng khuẩn 62
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả v
năng kháng khuẩn 64
4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả
năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 69
4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả
năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 73
4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng
khuẩn của hạt nano chitosan 76
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79
5.1. Kết luận 79
5.2 Kiến nghị
79
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
HPLC
MIC
DNA
pDNA
DEMC
TPP
PMAA
CS
CMC
CNP
TEM
SEM
kDa
E.coli
S.aureus
LMWC
Sắc kí lỏng cao áp
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang 2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế
và khả năng hấp phụ BSA 8
2.2. Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles
hấp phụ với pDNA 11
2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng
dụng trong sinh y học 15
2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24
2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25
2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh
Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27
4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến tính
chất hạt nano chitosan 50
4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano
chitosan (Chitosan 30kDa) 56
4.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn
của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và
Staphylococcus aureus 62
4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và
chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65
4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và
chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67
4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng
ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
STT Tên ñồ thị Trang 4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 20 kDa 53
4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 30 kDa 54
4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng
lượng phân tử 300 kDa 55
4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan
với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57
4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ
CS:TPP là 4:1 58 xiDANH MỤC CÁC HÌNH
xii
4.6. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 5:1 59
4.7. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP làà 6:1 60
4.8. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 7:1 61
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
xiv 1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1.Tính cấp thiết
Khoa học và công nghệ nano là một lĩnh vực mới trong những năm gần
đây nhưng đã và đang phát triển nhanh chóng vì sự hiệu quả và những ứng
dụng rộng rãi của nó trong nhiều ngành như sinh y học, điện tử, vật lí, hóa
học. Vật liệu nano với kích thước nanomet siêu nhỏ đã thể hiện nhiều tính
chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đang
xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn để đầu tư phát triển.
Việt Nam là nước đang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm ở mức rất
thấp và chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như: môi trường ô nhiễm dẫn đến ô
nhiễm vào nông sản và vật nuôi, quy trình sản xuất và chế biến thực phẩm
còn nhỏ lẻ, không đáp ứng điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, hủ tục lạc
hậu trong ăn uống hoặc vì lợi nhuận mà sử dụng phụ gia, bảo quản ngoài
danh mục bộ y tế, kiểm soát thực phẩm qua biên giới và trên thị trường chưa
chặt chẽ đang gióng lên hồi chuông báo động hơn bao giờ hết. Các thuốc
kích thích ở vật nuôi, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, melanin trong sữa và
nước mắm, 3-MCPD trong nước tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex
trong thủy hải sản , đặc biệt thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn đã gây ra
tăng cường hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính kháng khuẩn. Vì vậy,
việc nghiên cứu tạo hạt nano nhằm tăng cường tính kháng khuẩn của chitosan
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là vấn đề cấp thiết hiện nay. Ở Việt Nam,
Nguyễn Anh Dũng đã sử dụng chế phẩm chitosan để ức chế sinh trưởng của
vi khuẩn Escherichia coli, nghiên cứu tạo hạt nano chitosan làm tá chất miễn
dịch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên động vật.
Xuất phát từ đó tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các
ñiều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano
chitosan”
1.2. Mục tiêu ñề tài
1.2.1. Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan bằng tripolyphosphate (TPP). 3
1.2.2. Xác định các điều kiện tối ưu để nâng cao hiệu quả kháng khuẩn của
hạt nano chitosan.
1.3.Ý nghĩa khoa học
Tạo hạt nano chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn là hoàn
toàn mới tại Việt Nam.
1.4.Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của đề tài sẽ đẩy nhanh việc sử dụng vật liệu nano chitosan
trong bảo quản, phòng chống nhiễm khuẩn ở thực phẩm ở Việt Nam. Đây là
vật liệu an toàn cho sức khỏe con người và phổ biến, giá thành hạ phù hợp với
điều kiện kinh tế của nhân dân.
1.5.Giới hạn ñề tài
Do thời gian có hạn, thiết bị, hóa chất hạn chế nên tôi chỉ tiến hành
nghiên cứu quy trình tạo hạt nano chitosan, bước đầu thử nghiệm trên hai loại
vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus.
chitin, chitosan bị khử. Mức độ deacetyl hóa tỷ lệ thuận với mật độ của nhóm
NH
3
+
trong phân tử do đó ảnh hưởng đến tính chất đa điện phân và độ tan của
chitin, chitosan. Chitin có mức độ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng
10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin)
có mức độ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi đó chitosan phải có mức độ
deacetyl hóa > 50%, với mức độ deacetyl hóa này chitosan mới dễ tan trong 5
một số acid hữu cơ loãng như acetic, lactic. Mức độ deacetyl hóa được xác
định bằng nhiều phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sắc ký
lọc gel, UV spectrophotometry,
1
H NMR,
13
C- NMR, phương pháp chuẩn độ
và HPLC theo Kumar (2000) [21].
Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể xác định bằng HPLC.
Tuy nhiên phương pháp đơn giản nhất, nhanh là đo độ nhớt, dựa vào các hằng
số α và K trong phương trình Mark – Houwink:
[η] = K.M
α
= 1.81 x 10
-3
M
0.93
2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan
Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet.
Chitosan nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng đi qua màng tế
bào, diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh
y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ sinh học làm vector chuyển gen.
Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan. Theo Sulnin (2004)
5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch
nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation)
trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp
tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây
(sieving method). Trong đó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong
tripolyphosphate[43].
2.2.1.1. Phương pháp tạo chitosan nanoparticles bằng liên kết cộng hóa trị
Ohya đã nghiên cứu tạo nano chitosan để nhốt thuốc chống ung thư 5-
FU bằng cách cho dung dịch chitosan khâu mạch cộng hóa trị với
glutaraldehyde. Nhóm kép - CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –
NH
2
của chitosan để khâu mạch (cross-linking) tạo nano chitosan. Phương
pháp này có ưu điểm là kích thước và tính chất hạt nano chitosan rất ổn định
[11]. 7
2. 2.2.1.Phương pháp tạo gel ion
Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan điện tích
dương và TPP, polyacrylic acid, polyaspartic acid, plasmid DNA (pDNA)
mang điện tích âm.
Để tạo nano chitosan –TPP: Dung dịch chitosan được hỗn hợp với dung
(mV)
Không
có
BSA
Phương
pháp hợp
nhất với
BSA
phương
pháp ủ
với
BSA
Không
có
BSA
Phương
pháp hợp
nhất với
BSA
Phương
pháp ủ
với
BSA
3,0 222,6 338,4 691,4 + 46,3
+ 46,3 + 43,2
2,5 210,5 344,5 623,7 + 47,9
+ 48,3 + 46,3
2,0 191,1 292,5 540,5 + 52,0
gia tăng đột biến kích thước hạt nano CS-PMAA. Khác với phương pháp tạo
hạt nano chitosan –TPP, tỷ lệ CS càng cao thì kích thước hạt càng nhỏ trong
khoảng pH<6 và ngược lại. Kết quả này được minh chứng rõ ràng bằng hình
chụp TEM của hạt nano CS-PMAA. Kích thước hạt nano CS-PMAA biến
động từ khoảng 20 nm – 140 nm ở pH <6 [31]. Chitosan
nanoparticl10
Hình 2.3. TEM của hạt nano CS-PMAA; a) CS 0.2%; b) CS 0.5%.
Nano chitosan cũng có thể thực hiện bằng cách tạo phức hợp
chitosan/pDNA nhờ khả năng tạo gel ion giữa DNA mang điện tích âm và
chitosan mang điện tích dương. Phương pháp này thường được ứng dụng
trong kỹ thuật chuyển gen, liệu pháp gen. Russell Mumper (2001) đã công bố
sử dụng chitosan, chitosan oligomer phối hợp với carboxymethyl cellulose
(CMC) với tỷ lệ khác nhau có hấp phụ trên bề mặt pDNA để tạo nanoparticles
ứng dụng trong chuyển gen. Các thông số vật lý của chitosan oligomer/nano
CMC phủ pDNA cũng được xác định (bảng 2.2).
Yongli Zheng (2007) cũng nghiên cứu tạo nano bằng cách tạo phức hợp
giữa chitosan và polyaspartic dựa trên nguyên lý tạo gel ion. Kích thước hạt
300 299 ±53 -7 96.1
400 178 ± 15 -25 99.1
3:1 50 275 ± 11 20 99.9
100 949 ± 155 16 100.0
200 225 ± 31 -2 99.9
300 134 ±12 -24 85.7
400 162 ± 8 -29 99.1
2.2.1.3. Phương pháp tạo giọt coasecva (phương pháp kết tủa)
Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong
dung dịch có pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva
ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có
thể là NaOH, NaOH-methanol hoặc ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ
được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano chitosan như
hình 2.4.
Copyright: Tài liệu đại học ©