BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B
BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến i

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B 3
1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus 4
1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh 4
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV 5
1.2.3. Sự tái bản DNA 6
1.2.4. Các thành phần kháng nguyên 6
1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh 7
1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam 9
1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới 9
1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước 10
1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và
điều trị HBV 11
1.4.1. Đường lây của HBV 11
1.4.2. Triệu chứng lâm sàng 13
1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 13
1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 15
1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn

ELISA Enzyme Linked Immuno Assay
HBV Hepatitis B Virus
HBcAg Hepatitis B core Antigen
HBeAg Hepatitis B envelope Antigen
HBsAg Hepatitis B surface Antigen
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
Nu Nuleotide
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucle acid
T
m
Nhiệt độ nóng chảy của mồi Khóa luận tốt nghiệp
SVTH : Võ Thị Hải Yến iv

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính
hiển vi điện tử 3
Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B 4

I. Đặt vấn đề
Viêm gan siêu vi B do Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến trên
toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn
tới xơ gan và ung thư gan. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có
khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có
khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chuyển
sang mãn tính ở người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ này lên đến 90%. Tỷ lệ tử
vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm
gan mãn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong 1
triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số
nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan
nguyên phát có nhiễm HBV.
Một trong những kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan
siêu vi B được sử dụng hiện nay là phương pháp Real-time PCR, cho kết quả
nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính.

II. Mục tiêu đề tài
Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên ngoài biện pháp phòng ngừa thì vấn đề
điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang
rất quan tâm. Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên
thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự
đang nhiễm HBV hay không. Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu
cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định
lượng được HBV trong máu.

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

2


3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B
1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19]
Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B
Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân
số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển.
1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5]
Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người
trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa. Tất
cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa.
Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây
truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên
một người ở Châu Úc).
HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh
nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt
Dane.

Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn
dưới kính hiển vi điện tử [23]
Khóa luận tốt nghiệp

polymerase, protein kinase.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

5
1.2.2. Cấu trúc bộ gene của HBV
Phân tử DNA của virus có dạng vòng, chứa khoảng 3,2Kb gồm hai mạch
đơn có chiều dài khác nhau: một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh
và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase.

Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18]

Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định: gene S, gene C, gene P và
gene X.
v Gene S (surface)
Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm ba vùng (pre S1, pre S2, S)
mã hóa ba loại protein của HBsAg.
- Vùng S mã hóa protein nhỏ (là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số) chứa
226 acid amin, có vị trí gắn glucose.
- Vùng S và pre S2 mã hóa loại protein trung bình chứa 281 acid amin,

chiều dài hai mạch DNA và mạch [+] luôn ngắn hơn mạch [-].
1.2.4. Các thành phần kháng nguyên
v Kháng nguyên bề mặt (HBsAg)
HBsAg được tìm thấy trong huyết thanh người dưới dạng một thành
phần của virus hoàn chỉnh hay dạng không hoàn chỉnh.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

7
Năm 1968, Bayer và cộng sự đã quan sát được hai dạng HBsAg dưới
kính hiển vi điện tử.
- Dạng hình cầu có đường kính 17 - 25nm.
- Dạng hình ống có đường kính khoảng 20nm, chiều dài thay đổi có thể
lên đến vài trăm nm.
Cấu tạo hóa học của cả hai dạng này gồm: protein, carbohydrate, lipid,
không có nucleic acid nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV.
HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định
nhiễm HBV. Đồng thời các mẫu huyết thanh có HBsAg sẽ là nguồn cung cấp
kháng nguyên rất tốt, có thể làm vật liệu cho các phản ứng huyết thanh học áp
dụng trong chẩn đoán.
v Kháng nguyên lõi
Gồm hai loại: HBcAg và HBeAg
- HBcAg được tìm thấy trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV, trong
huyết thanh người bị nhiễm. HBcAg hiện diện như là một thành phần
của một virus hoàn chỉnh, chứ không có ở dạng tự do.
- HBeAg là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh. Ở tế bào gan
HBeAg hiện diện trong tế bào chất, sẽ được giải phóng khỏi phần lõi
của virus khi xử lý với các chất mạnh.
1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh
Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27]
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

9
1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam [2],[4]
1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỉ
người bị nhiễm HBV và 350 triệu người mang mầm bệnh mãn tính.
Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mãn tính,
xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người.
Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác
nhau:
- Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ.
- Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á.
- Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông,
Ấn Độ và Nam Phi.
- Genotype E phổ biến ở Tây Phi.
- Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska.
- Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ.
- Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản.

hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu
dịch tễ học thống nhất.
1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước
Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu
gene B và C. Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất
virus mới. Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ
xâm lược. Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế
bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi. Nhưng ở một
số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang
virus viêm gan B mãn tính. Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào
trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá
hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

11

Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng
nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia
có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công
trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Không phải tất
cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì
đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch
bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus.
Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu
bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mãn tính và lượng virus
tăng cao.
v Lây truyền qua đường ngoài tiêu hóa do tiếp xúc với máu, các vật
phẩm của máu
Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền
máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận,…
Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các
dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hóa,
châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma
túy sử dụng chung ống tiêm.
HBV có tính đề kháng tương đối và bền vững khi được bảo quản ở nhiệt
độ -20
o
C trong nhiều năm, có thể tồn tại ở 60
o
C trong bốn giờ.
v Lây truyền qua đường tình dục
Máu và các chất dịch của cơ thể như nước bọt, tinh dịch hoặc dịch âm
đạo đều chứa virus.
v Lây truyền từ mẹ sang con
HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau
thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tùy thuộc vào
hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở
mẹ.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

13

1.4.2. Triệu chứng lâm sàng
- Viêm gan cấp tính

14

Tuyệt đối không dùng chung các dụng cụ có thể gây xây xát da, niêm
mạc (dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ y tế … hoặc truyền máu) để tránh lây
lan từ người bệnh.
Quan hệ tình dục có bảo vệ, có thể ngăn chặn sự lây nhiễm HBV.
v Điều trị
Khi mắc bệnh viêm gan B, thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu của bệnh
nhân để tìm các dấu hiệu của bệnh gan. Hai yếu tố sẽ xem xét kĩ lưỡng là
lượng siêu vi (lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu, và các enzyme của
gan có thể cho biết tình trạng tổn thương gan. Kiểm soát lượng siêu vi trong
máu, duy trì lượng enzyme ở mức bình thường, và tăng cường hệ miễn dịch
của bệnh nhân để ngừa bệnh hiệu quả. Hiện nay, có các loại thuốc giúp có tác
dụng chữa bệnh viêm gan B, nhưng không thể chữa khỏi được. Các loại thuốc
này được gọi là interferon và thuốc kháng siêu vi.
- Interferon
Interferon, một chất đạm tự nhiên trong cơ thể, có tác dụng tăng cường
hệ miễn dịch để ngừa bệnh. Các nhà nghiên cứu đã bào chế các loại interferon
tổng hợp có tác dụng giúp hệ miễn dịch chống viêm nhiễm trong gan và tăng
lượng kháng thể chống loại siêu vi này. Interferon có thể giúp cải thiện tình
trạng sức khỏe lá gan và giảm bớt lượng siêu vi trong gan. Việc điều trị bằng
interferon thường diễn ra trong một thời gian nhất định, thường là vài tháng,
và có thể giúp cải thiện vĩnh viễn tình trạng sức khỏe của gan mà không gây
ra triệu chứng kháng siêu vi. Chính vì vậy, interferon là biện pháp điều trị tốt
nhất được nhiều người lựa chọn đầu tiên, do nó có hoạt tính chống virus và
kích thích hệ miễn dịch.
- Thuốc kháng siêu vi
Thuốc kháng siêu vi (dạng thuốc viên hoặc thuốc nước) can thiệp vào
quá trình tái tạo HBV để ngăn chặn tình trạng tái tạo siêu vi HBV mới.
Khóa luận tốt nghiệp

Các bước cơ bản:
- Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết, được gắn trên một bề mặt.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến

16

- Kháng thể - antibody (KT) biết trước. Kháng thể này được gắn kết với
enzyme.
- Thêm vào một cơ chất (subtance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và
tạo tín hiệu có thể xác định được.
- Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa
KN - KT. Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết định cường độ
sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh
hưởng đến kết quả xét nghiệm.
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử
1.5.2.1. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng DNA nhánh (bDNA)
[8]
Là phương pháp phát hiện và định lượng DNA (hoặc RNA) bằng kỹ
thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn là các giếng thử nghiệm. Phương
pháp được thực hiện theo các bước sau: (1) HBV-DNA nếu có trong mẫu thử
sẽ lai với các đoạn dò đích (target probes), có hai loại: một loại có đầu đặc
hiệu với đoạn dò tóm bắt, một loại có đầu đặc hiệu với DNA nhánh (bDNA).
(2) Trên bề mặt của các giếng thử nghiệm có gắn các đoạn dò tóm bắt
(capture probes). Các đoạn dò này sẽ tóm bắt các đoạn dò đích, đã được lai
với HBV-DNA, nhờ đó đã tóm bắt HBV-DNA lên giếng thử nghiệm. (3) Các

DNA. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính
Nhiệt độ phản ứng là 94
o
C trong 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử
DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các enzyme
đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc
bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn bắt cặp
Các primer (đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (khoảng 20 - 25 Nu) sẽ bắt
cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt
cặp này sẽ có hai ý nghĩa đặc hiệu: đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn
gene mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gene khuếch
đại.
- Giai đoạn kéo dài
Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng
của enzyme Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu vào các
primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành
nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới
đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA
có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu.
Chu kỳ này được lặp lại nhiều lần (30-40 lần), kết quả từ một số lượng
DNA đích ban đầu (N), sau n chu kỳ sẽ tạo thành N x 2
n
bản sao.
Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Võ Thị Hải Yến