BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------------------
Đặng Hồng Cúc
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CYTOMEGALOVIRUS (CMV) TRONG MÁU, NƯỚC
TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
REAL-TIME PCR
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CAO MINH NGA
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- BLAST: Basic local alignment tool
- CMV: Cytomegalovirus
- COBAS: COBAS AMPLICOR™ CMV MONITOR
-
CSF: Cerebrospinal fluid: dịch não tủy.
- Da: Dalton, đơn vị đo khối lượng phân tử protein.
- DNA: Deoxyribonucleic acid
- dNTP: Deoxynucleoside triphosphate
-
dNTP: deoxynucleotie triphosphate
- dUTP: deoxy Uracil triphosphate.
- EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid.
- gB: glycoproteinB
- GE: genome-equivalent
- IDT: Intergrated DNA Technologies
- IE: immediate early: sớm tức thì
-
LC-PCR: LightCycler® polymerase chain reaction
- PBL: Peripheral blood leucocytes: bạch cầu máu ngoại biên
-
PMNLs: polymorphonuclear leucocytes: bạch cầu đa nhân
-
Pol: polymerase.
-
PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder: rối loạn tăng sinh tế
bào lympho sau ghép.
- qPCR: quantitative polymerase chain reaction: PCR định lượng
- UL: unique long
Tài liệu
tham khảo
PP định lượng Mẫu thử
Số lượng
gen
virus/ml
mẫu thử
Biểu
hiện
triệu
chứng
Không
biểu
hiện
triệu
chứng
Jayne C.Fos [41]
năm 1995
PCR (gB) Nước tiểu 10
6,5
x
Jayne C.Fos [41]
năm1995
PCR (gB) Nước tiểu 10
5,2
x
Lazzarotto[47]
năm 2000
qcPCR (IE1) Dịch ối 10
5
x
Ravit Arav-Boger
[66] năm 2007
Real-Time
qPCR (US17)
Dịch ối 2,8x10
5
x
Ravit AravBoger
[66] năm 2007
Real-Time
qPCR (US17)
Dịch ối 8x10
3
x
Vì vậy, việc định lượng CMV sẽ giúp các bác sĩ tiên lượng và có liệu pháp chữa trị sớm. Phát
hiện kháng nguyên pp65 trong máu cũng giúp cho việc định lượng CMV hữu hiệu, nhanh, nhưng
cũng còn nhiều nhược điểm. Trong thời gian gần đây, từ 1993 đến nay phương pháp Real-Time
PCR được sử dụng nhiều ở nước ngoài [18], [26], [27] ,[28], [32], [33], [42], [46], [53], [56], [59],
[70] định lượng CMV nhanh, chính xác , độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã giúp cho sự tiên lượng
những bệnh nhân nhiễm CMV có nguy cơ phát triển thành bệnh CMV để kịp thời chữa trị, đồng
thời còn giúp cho việc theo dõi kiểm tra hiệu lực liệu pháp chữa trị.
Tại Việt Nam cho đến nay, ở miền Nam Việt Nam, một vài nơi như công ty cổ phần công
nghệ Việt Á, công ty khoa Thương, công ty Nam Khoa, bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, bệnh
viện Chợ Rẫy có kit thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân bằng Real-Time PCR, chưa thấy công
trình nào xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR.
Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Xây dựng quy trình định lượng
CMV trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR”.
Giới hạn đề tài:
vùi hiện diện trong thận của một em bé tử vong do giang mai. Năm 1907, phòng thí nghiệm
của Ribbert tiếp tục phát hiện các thể vùi của 4 trong 30 tuyến mang tai của những đứa trẻ từ 2
tháng đến hai tuổi. Nhưng ông sai lầm khi cho rằng nguyên nhân là do động vật nguyên sinh (có tên
là Entamoeba mortinatalium). Vào năm 1920, Goodpasture và Talbert là những người đầu tiên cho
rằng tề bào bị phình to có thể là do hậu quả của nhiễm virus, và Goodpasture đề nghị sử dụng thuật
ngữ “Cytomegalia” là để chỉ sự phồng to của tế bào bị nhiễm. Vào 1956, Smith và Rowe phân lập
được CMV từ tuyến dưới hàm hoặc tuyến amidan của em bé, và CMV được gọi là: “virus của tuyến
nước bọt”, hay là “virus gây bệnh thể vùi của tuyến nước bọt”.
- Đến năm 1960, Weller và cộng sự đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalovirus” bởi vì
thuật ngữ “bệnh virus của tuyến nước bọt-CID (Cytomegalic inclusion disease)” khó sử dụng và sai
lầm, do tuyến nước bọt chỉ là một trong nhiều vị trí bị nhiễm, Klemola và Kaarrianinen đã mô tả
bệnh tăng bạch cầu đơn nhân do CMV(1965), cùng năm ấy người ta phát hiện CMV ở một bệnh
nhân được ghép thận. Trong hai thập niên 1970 và 1980, sinh học phân tử của CMV được tiếp tục
các nhà khoa học nghiên cứu và khám phá.
1.1.2. Phân loại CMV ở người
CMV ở người là Human Cytomegalovirus (HCMV) là thành viên của giống Herpesvirus và
thuộc họ Herpesviridae, chi Betaherpesvirinae. Nhân là sợi đôi DNA. Có 8 loài virus Herpes ở
người được chia làm 3 phân họ (bảng 1.1).
Bảng 1.1: 8 loài virus Herpes gây bệnh ở người
Phân họ TT VIRUS Bệnh liên quan Alpha-
herpesvirinae
1 HSV-1 Mụn rộp ở môi
2 HSV-2
Mụn rộp ở bộ phận sinh dục,
gây ung thư cổ tử cung.
3
VARICELLA-ZOSTER
1.2. Tình hình nhiễm CMV [3], [6], [11], [12], [13], [14], [16], [20], [23], [24], [29],[31],
[50], [51], [52], [60], [71], [72]
CMV là virus có mặt ở khắp nơi và thường gây nhiễm cho nhiều loài sinh vật khác nhau,
nhưng cũng là tác nhân sinh bệnh thường gặp ở người. CMV gây bệnh cho người đã được ghi nhận
từ thời cổ đại. Người ta tìm thấy dấu vết của nhiễm CMV trong các bộ lạc Da Đỏ cổ đại ở Nam Mỹ
(ngày nay thuộc lãnh thổ Brazin).
Tỷ lệ nhiễm CMV tùy thuộc vào vị trí địa lý, tình trạng kinh tế xã hội, yếu tố nuôi dưỡng và
giáo dục, tỉ lệ nhiễm CMV trung bình trên thế giới là khoảng 40%. Ở Mỹ, từ 50% đến 80% số người
lớn trên 40 tuổi đều nhiễm CMV, phụ nữ ở lứa tuổi sinh đẻ tỉ lệ nhiễm CMV là 60-65%, 0,7-4% phụ
nữ mang thai nhiễm CMV nguyên phát, nhiễm sang thai nhi là 30- 40%, trong 40% nhiễm bẩm sinh
có 10% xuất hiện triệu chứng bệnh CMV, 5-15% trong số 90% còn lại sau một vài năm có biểu hiện
di chứng muộn của CMV như khiếm khuyết nghe, nhìn và chậm phát triển tinh thần.
CMV gây nhiễm ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên lứa tuổi thiếu niên là là độ tuổi thường bị nhiễm
nguyên phát, và tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần theo lứa tuổi. Theo thống kê ở Hoa kỳ với tuổi từ 6-11
tuổi là 36,3%, lớn hơn hoặc bằng 6 tuổi tỉ lệ nhiễm là 58,9%, từ 80 tuổi trở lên tỉ lệ nhiễm là 90,8%.
Nhiễm CMV còn khác nhau ở các chủng tộc: 51,2% ở Tây Ban Nha không phải người da trắng,
75,8% ở Tây Ban Nha không phải người da đen, và 81,7% ở người Mỹ gốc Mexico. Mỗi năm tại
Hoa Kỳ khoảng 340.000 người không phải gốc Tây Ban Nha da trắng, 130.000 người không phải
gốc Tây Ban Nha da đen, và 50.000 phụ nữ Mỹ gốc Mexico bị nhiễm CMV nguyên phát. Đối với
bệnh nhân AIDS, hơn 40% bị nhiễm CMV, những người cấy ghép nội tạng, nếu không có sự can
thiệp kháng virus thì sẽ biểu hiện triệu chứng nhiễm CMV: 39-41% ở những người ghép tim, phổi;
9-35% ở những người ghép tim; 22-29% ở những người ghép gan và tụy; 8-32% ở những người
ghép thận; 50% ở những người ghép thận và tụy; 22% ghép đoạn ruột.
Ở miền Nam Việt Nam từ 16 ca ghép thận đầu tiên ở Chợ Rẫy [3] ghi nhận được số liệu ở
bảng 1.2.
Bảng 1.2: Tần suất nhiễm CMV ở 16 ca ghép thận
Huyết thanh dương tính Người cho thận Người nhận thận
IgG-CMV 12/16 13/16
IgM-CMV 3/16 2/16
của bộ gen virus là vùng mang các gen mã hóa cho các protein quan trọng cần thiết cho sự
xâm nhập và sao chép của virus như UL55 mã hóa cho glycoprtein B trên màng bọc ngoài, UL123
mã hóa cho protein IE, bộ gen của CMV còn có những vùng xác định tương đồng với một số vùng
trên DNA người [6]. Đây là bộ gen có kích thước lớn nhất trong họ virus Herpesviridae, xấp xỉ 230-
240Kb (hình 1.3). Có khoảng 31% - 75% Guanin+ Cytocine. Với bộ gen > 240.000bp, có tiềm năng
mã hoá protein cho hơn 200 khung đọc mở (opening reading frames) và có khả năng tổng hợp
khoảng 100 protein của virus. Hiện nay, mới xác định được một vài protein từ bộ gen virus. Có
những đoạn gen mã hoá quan trọng cần cho sự sao chép của virus, nhưng cũng có đoạn gen không
thiết yếu, nhưng lại sản sinh ra yếu tố lây truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Hình 1.3: Minh họa bộ gen của một số loài Herpesvirus
“Nguồn:http://cmbi,bjmu,edu,cn/www-learn/micro-ac uk/335/HHV5,html
”
Hình1.4: Mô tả
cấu trúc chi tiết bộ gen của CMV.
“Nguồn:http://www,nist,gov/cstl/biochemical/genetics/cmv_structure,cfm
”
tiêu cho các kháng thể trung hoà virus. Các glycoprotein này sẽ quyết định các dòng CMV khác
nhau. Các glycoprotein được biết rõ nhất trong lớp vỏ ngoài này là gp 116, gp58, gp86.
glycoprotein
envelope
chất nền
nucleocapsid
- Một phát hiện cho thấy glycoprotein của vỏ bọc virus có vai trò tạo ra đáp ứng miễn dịch
của cơ thể, nhưng một số khác góp phần làm giảm đáp ứng miễn dịch tế bào của túc chủ bằng cách
giới hạn sự trình diện kháng nguyên của virus.
1.4. Đặc điểm của virus [9]
1.4.1. Tính bền vững
CMV là virus không bền vững, dễ bị bất hoạt bởi các yếu tố như : dung môi lipit,
pH<5, CMV chỉ tồn tại một giờ ở nhiệt độ 37
0
C, 30 phút ở 50
0
C hay 5 phút dưới tia cực tím. Bị mất
khả năng gây nhiễm ở -20
0
C - 37
0
C, CMV có thể tồn tại ở môi trường tự nhiên bên ngoài trong
nhiều giờ, có thể bảo quản CMV ở 4
0
C trong nhiều ngày mà không mất khả năng gây nhiễm. Bảo
quản CMV ở nhiệt độ -70
0
C trong nhiều tháng không làm mất khả năng gây nhiễm. Ở nhiệt độ -
190
0
- Gây thải ghép cấp và mạn.
- Giảm chất lượng sống, tăng chi phí
điều trị
1.5. Quá trình xâm nhập của CMV vào tế bào [6], [14], [51], [72]
1.5.1. Đường lây truyền
Lây truyền CMV có thể xảy ra từ người này sang người khác, thông qua các sự tiếp xúc
với dịch thể nhiễm CMV (nước tiểu, nước bọt, sữa mẹ, máu, nước mắt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo
v,v…) chẳng hạn như hôn, quan hệ tình dục, và dính nước bọt hay nước tiểu nhiễm CMV trên tay
rồi sau đó chạm vào mắt của mình, hoặc bên trong miệng, mũi…).
CMV cũng có thể truyền qua tử cung, nhau thai, hay những mô, cơ quan ghép mà người
cho bị nhiễm CMV.
Bạch cầu và tế bào CD 13+ là nơi tập trung chủ yếu của CMV. Do đó, virus cũng có thể
lây nhiễm khi truyền máu.
1.5.2. Quá trình xâm nhập (hình 1.7)
- Virus vào tế bào túc chủ bằng cách kết hợp và hoà lẫn vỏ của virus với màng tế bào của
túc chủ hay qua hiện tượng thực bào.
- Khi virus xâm nhập vào tế bào đích, sẽ có sự tham gia của tất cả các cấu trúc của virus
như những phức hợp glycoprotein và các phân tử ở màng tế bào túc chủ như heparan sulphat,
proteoglycan, và một loại membrane-bound protein có trọng lượng phân tử là 30-34 kD. Tác động
đầu tiên của HCMV đối với tế bào túc chủ là sự hút bám: Liên kết với sulphat heparan của tế bào
túc chủ qua tương tác cacbonhydrat, chủ yếu là gpUL100(gM), nhưng cũng có thể là gpUL55(gB),
sau đó gắn với HLA bề mặt tế bào, tương đồng HLA(gpUL18), tương tác qua microglobulin B2 và
gắn với thụ thể tế bào 32-34kD (có thể là gpUL55).
- Sau khi hút bám, virus bắt đầu di chuyển xuyên qua màng tế bào. Sau đó, một loại những
phản ứng sinh lý tiếp theo xảy ra trong vòng vài phút, dẫn đến hiện tượng thủy phân
phosphatidylinositol(4,5)-biphosphate và kích thích quá trình chuyển hoá của axit arachidonic. Axit
này sau đó được biến đổi thành prostalandin H
2
. Những hoá chất trung gian này được cho hoạt hoá
khả năng gây bệnh khi nhiễm CMV, CMV có đặc tính sống âm ỉ và kéo dài. Trong giai đoạn sống
tiềm ẩn virus không nhân lên trong tế bào túc chủ. Đối với nhiễm CMV mạn tính và ngay cả nhiễm
CMV hoạt động thể yên lặng, cũng không có virus đang hoạt hóa. Sự tiềm ẩn virus trong tế bào đơn
nhân là mối nguy hiểm bởi vì đó là nơi ẩn náu kín đáo của virus và từ đây chúng theo hệ tuần hoàn
phát tán khắp cơ thể, đồng thời, tế bào đơn nhân còn duy trì virus khi nó biệt hoá thành đại thực bào.
Ngoài ra, người ta còn thấy CMV có khả năng tạo ra cơ chế né tránh đáp ứng bảo vệ của cơ
thể, vì vậy nhiễm CMV cũng đưa đên bội nhiễm các loại nhiễm trùng cơ hội khác như Pneumocystis
carini, Aspergillus fumigatus, Candida albicans hay các loại vi khuẩn, virus khác. Đặc biệt là các
virus trong họ Herpes, viêm phổi và nhiễm nấm thường xảy ra sau khi nhiễm CMV. Sự đảo ngược
huyết thanh HHV-6 sau khi ghép gan có thể được xem là yếu tố báo trước cho bệnh CMV, HHV-6,
bản thân nó rất hiếm gây triệu chứng lâm sàng trầm trọng, trừ khi đồng nhiễm CMV. Nếu tìm thấy
DNA của HHV-6 và CMV trong nước tiểu hoặc trong huyết thanh thì đây là yếu tố chắc chắn dự
đoán trước bệnh CMV sẽ xảy ra [65].
CMV còn tạo thêm một số cơ chế gây cản trở sự bảo vệ của cơ thể chủ. Một trong các cơ chế
đó là giảm điều hoà sự biểu lộ các phân tử lớp I của phức hợp chủ yếu hoà hợp mô (MHC) làm cản
trở sự nhận biết của các tế bào lympho T độc. Các protein của CMV người còn ức chế vận chuyển
các kháng nguyên được xử lý, giữ lại các phân tử lớp I của MHC trong lưới nội nguyên sinh và tái
sinh để trả lại cho bào tương các chuỗi nặng của lớp I MHC. Thiếu các phân tử lớp I MHC đáng lẽ
các tế bào nhiễm CMV sẽ bị các tế bào diệt tự nhiên (NK) tiêu hủy nhưng các tế bào nhiễm CMV
lại biểu lộ phân tử gpUL 18 tưong ứng với các phân tử lớp I MHC. Hơn nữa CMV còn có một
kháng nguyên gpUL 40 có khả năng tăng điều hoà phân tử HLA-E thuộc lớp I không kinh điển
MHC. Phân tử HLA-E ức chế tác động của tế vào NK bằng cách gắn kết với receotor lectintip C
trên tế bào NK. Sau cùng CMV sản xuất một phân tử tương tự IL-10, có khả năng ức chế tổng hợp
cytokin và làm mất vai trò trình diện và đồng đáp ứng miễn dịch của đại thực bào .
1.7. Những dấu hiệu nhận biết và triệu chứng bệnh CMV
1.7.1. Đặc điểm cơ bản của bệnh CMV gây ra là những thể vùi khổng lồ hình “mắt cú” trong
nhân tế bào bị nhiễm (hình 1.1).
1.7.2. Triệu chứng lâm sàng
1.7.2.1. Với nhiễm CMV bẩm sinh
- Trẻ sơ sinh của những người mẹ nhiễm CMV nguyên phát thường dễ đưa đến diễn tiến
tỷ lệ tế bào giúp đỡ đối với tế bào ức chế và có thể gián tiếp đưa đến gia tăng tình trạng nhiễm trùng
cơ hội và gây ra thải ghép. Nhiễm CMV còn tạo kháng thể kháng tế bào nội mô mà có thể đưa đến
nguy cơ thải ghép cấp và thải ghép mạn.
Triệu chứng sốt kéo dài 3-4 tuần là dấu hiệu nguy nhất của hội chứng CMV. Triệu chứng sốt
kèm theo những dấu hiệu và triệu chứng của bệnh xâm lấn. Viêm phổi, tổn thương ống tiêu hoá,
viêm túi mật, viêm thực quản, viêm gan, viêm võng mạc cũng có thể xày ra.
Trong các bênh nhân ghép tạng hậu quả của bệnh CMV là giống nhau: Viêm tụy xuất hiện ở
người nhận tụy, viêm phổi -xuất hiện ở những người ghép phổi hoặc ghép tim -phổi, viêm gan ở
những người nhận gan ghép. Bệnh nhân ghép thận có tổn thương viêm vi cầu thận thể hình liềm và
hoại tử với thể vùi bên trong vi cầu…, nhiễm CMV vẫn còn là một biến chứng có ý nghĩa sau ghép
tế bào nguồn tuỷ xương. Tóm lại tạng được ghép là nơi thường dễ bị nhiễm CMV nhất. Mối liên hệ
nhân quả giữa CMV và tổn thương tạng ghép vẫn còn là suy đoán và nhiều nghiên cứu cần được
chứng minh cho mối liên hệ này.
1.7.2.4. Đối với bệnh nhân AIDS
Nhiễm CMV gây ra nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hoá hoặc hệ thần kinh trung ương [9].
Nhiễm CMV xảy ra 21-44% bệnh nhân AIDS- nhất là bệnh nhân có tế bào lympho CD
4
+
dưới 100 tế bào/mm
3
[71], tỉ lệ viêm võng mạc trên bênh nhân AIDS có nhiễm CMV là 85%.
1.8. Phòng ngừa và điều trị
1.8.1. Phòng ngừa
Ngày nay các thầy thuốc lâm sàng đều quan tâm và chú trọng đến việc phòng ngừa nhiễm
CMV bởi vì nếu để bệnh CMV bùng phát thì điều trị khó khăn, dự hậu xấu. Hiện nay có một số tiêu
chuẩn để phòng ngừa nhiễm CMV được chấp nhận.
- Tránh lây nhiễm.
- Tạo miễn dịch chủ động: sử dụng vaccin Towne sẽ tạo miễn dịch dịch thể và miễn dịch
đặc hiệu khá cao từ 84-97% [62].
1.9.3. Các tế bào nội mô khổng lồ (Cytomegalic endothelial cell - CEC)
Các tế bào được xác định bằng cách ly tâm phần tế bào đơn nhân của bạch cầu trên lam thủy
tinh sau khi nhuộm đặc hiệu tế bào nội mô.
Đối với người nhận tạng, CEC không thấy trong những trường hợp được điều trị dự phòng
hoặc điều trị trước. Trong tương lai, xét nghiệm này trong lĩnh vực ghép tạng sẽ được áp dụng rộng
rãi.
1.9.4. Phân lập virus
Là phương pháp thông thường và cổ điển nhất cho kết quả lâu (1-2 tuần),
1.9.5. Xét nghiệm tìm kháng nguyên trong máu (antigenemia assay)
Là phương pháp tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán nhiễm CMV ở những người được ghép
tạng. Các tế bào nhiễm CMV được xác định bằng các kháng thể đơn dòng kháng lại các protein đặc
hiệu của virus (ví dụ pp65). Đây là kỹ thuật đặc hiệu, độ nhạy cao và thông dụng nhất trong việc xác
định nhiễm virus trong máu.
1.9.6. Kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization- ISH)
Lai tại chỗ là lai phân tử mà trong đó một axit nucleic chuỗi đơn đã biết được gắn với chất
phóng xạ hoặc huỳnh quang. Đem phân tử này đặt vào các tế bào hay mảnh mô đã được chuẩn bị và
quá trình tác dụng (lai) sẽ xảy ra tại chỗ để tạo thành nhiều phân tử chuỗi kép. Nghiên cứu ISH có
thể sử dụng khi kết quả chẩn đoán mô- bệnh học còn nghi ngờ. Ứng dụng này dùng trong chẩn đoán
viêm phổi, viêm gan, viêm dạ dày ruột do CMV. Kỹ thuật thực hiện còn cồng kềnh.
1.9.7. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) xác định DNA của virus
PCR (polymerase chain reaction – phản ứng trùng hợp chuỗi): năm 1985, Kary B, Mullis
cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR. Đây là một kĩ thuật phân tử tạo dòng DNA rất
đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một
cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có
chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kĩ thuật tạo dòng DNA in vitro.
Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học.
PCR cho phép chẩn đoán nhanh nhiễm CMV, nhưng nếu kết quả dương tính cũng không cho
ta xác định được là virus mới nhiễm hay là nhiễm tiềm ẩn.
Real-Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dùng để định lượng có thể xác định
Hình1.8: Quá trình phát tín hiệu huỳnh quang của Molecular beacon
1.10.4.2. Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi: chất nhuộm này gắn với mọi phân tử DNA
mạch đôi và chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào chúng. Hai chất nhuộm phát huỳnh quang
thường được sử dụng là SYBR Green I và Ethidium bromide. Nhược điểm của phương pháp này
phản ứng sẽ cho kết quả định lượng không chính xác nếu có sản phẩm ký sinh (hình 1.9).
Hình1.9 : Cơ chế phát huỳnh quang của chất nhuộm SYBR Green I
1.10.4.3. Probe đôi (Hybridization probe): phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc
sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một probe sẽ gắn chất cho huỳnh
quang (fluorescein donor) ở đầu 3’ phát ánh sáng xanh, một probe sẽ gắn chất nhận huỳnh quang
(fluorescein accepter) ở đầu 5’và luôn chặn ở đầu 3’ DNA sao cho Taq polymerase không thể kéo
dài mạch từ đầu này. Ưu điểm của phương pháp này là việc thiết kế probe tương đối linh động, dễ
dàng hơn so với việc thiết kế beacon (hình 1.10).
Chất phát huỳnh quang
Quencher
Phát tín hiệu huỳnh quang
Hình1.10 : Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi.
1.10.4.3. Probe thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là TaqMan probe, probe này
được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (Quencher) ở đầu
3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher.
Trong phản ứng PCR, probe này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi
Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của primer đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện
hoạt tính 5’–3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của probe và thay bằng nucleotide mới,
lúc đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi probe và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng
dập tắt.
TaqMan probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với
mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện (hình
1.11).
2
.
Một phản ứng PCR định lượng tối ưu sẽ có hiệu quả khuyếch đại (E) cao 90-105% và đường
chuẩn tuyến tính R
2
>0,980.
Hình 1.13:. Kết quả các mẫu chuẩn từ 10
1
-10
6
copies
Hình1.14: Mô tả đường cong chuẩn [46].
Ghi chú: hình 1.14 cho ta R
2
(Correlation Coefficient)=1, hiệu quả khuyếch đại (PCR
Efficiency) E=96,2%.
Copyright: Tài liệu đại học ©