65

65

hóa học, vật lý như: thao tác kĩ thuật viên, ethidium bromide, tia UV,
dòng điện…làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và khả năng
ngoại nhiễm cao. Mặc khác, việc đánh giá kết quả được thực hiện
bằng mắt thường, vì vậy kết quả có thể không đồng nhất, kém thuyết
phục. Các yếu tố này có thể làm cho việc phân tích kết quả gặp khó
khăn.

Phƣơng pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR
Green
Trong thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 2 này, chúng tôi cũng giữ nguyên
các thành phần phản ứng và mẫu sản phẩm (10 mẫu). Các kết quả phản ứng được thể
hiện trên đồ thị DNA quantification như sau:
- Kết quả thí nghiệm trên mẫu đối chứng với cặp mồi đặc hiệu p35S.
Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng
Ghi chú:

Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2
phƣơng pháp 2
Tên mẫu
Chu kỳ ngƣỡng
Kết luận
Đối chứng +
Đối chứng -
27,62

6
7
8
9
10
- Bắp giống 1
- Bắp giống 2
- Bắp giống 3
- Bắp giống 4
- Bắp giống 5
- Bắp trái ăn tươi
- Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc
- Thức ăn gia súc 1
- Thức ăn gia súc 2
- Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B9
B10
B11
20,62
41,04
N/A
16,96
N/A

Bên cạnh đó, trong phương pháp 2, chúng tôi cũng đồng thời tiến hành phân
tích đồ thị nhiệt độ nóng chảy (Melt curve analysis). Kết quả thể hiện trên đồ thị như
sau:

Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng
Ghi chú:
Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm
Ghi chú:
B1 B2 B3 B4 B5
B6 B7 B9 B10 B11
Đối chứng dương
Đối chứng âm
68

68

Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm

Mẫu
Nhiệt độ nóng chảy
(
O
C )
Chiều cao của peak
(-d(RFU)/dT)
Đối chứng +
Đối chứng -

26,45
-
31,40
24,23

Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy:
- Đồ thị Melt curve của sản phẩm khuếch đại các mẫu dương tính đều xuất
hiện peak ở nhiệt độ trùng với nhiệt độ nóng chảy của đối chứng dương (86-
86,5
o
C).
- Độ cao các peak này đều xấp xỉ với độ cao của peak đối chứng dưong
(47,40). Sự chênh lệch có thể do số lượng DNA khuếch đại sau cùng của
mẫu thí nghiệm gây ra.
- Sản phẩm khuếch đại của các mẫu âm tính không xuất hiện các peak nhiệt
độ nóng chảy.
Như vậy, ta có thể rút ra một số kết luận như sau:
- Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại các mẫu dương tính là tương
đương với đối chứng dương. Nói cách khác, sản phẩm khuếch đại promoter
35S của chúng có cùng chiều dài và tương tự với đối chứng.
- Các kết quả nhận được từ đồ thị Melt curve khớp với kết quả của đồ thị
DNA quantification. Điều này chứng tỏ kết quả của phản ứng Real-Time
PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I là chính xác.
69

69

- Mẫu B11 tuy có chu kỳ ngưỡng phát hiện khá thấp, nhưng kết quả phân tích
trên đồ thị Melt curve cho thấy, đây là một sản phẩm đặc hiệu và có chất
lượng tốt của phản ứng khuếch đại bằng PCR.

Thấp
Cao
Giá thành
1-1,5 USD
1,5-3 USD
Công cụ
Đơn giản, giá thành thấp
Phức tạp, giá thành cao
Khả năng phát triển thành
kỹ thuật định lượng
Không
Có

Trên đây là một số chỉ tiêu so sánh mà chúng tôi rút ra được từ 2 phương pháp
của thí nghiệm 2. Chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
- Phương pháp Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I cho phép
phát hiện các trình tự DNA với độ nhạy cao và kết quả đáng tin cậy (tương
đương phương pháp PCR truyền thống). Điều này rất cần thiết cho quá trình
70

70

sàng lọc các sản phẩm biến đổi gen. Bên cạnh đó, phương pháp này còn có
một số ưu điểm sau:
Thời gian thao tác ngắn hơn so với phương pháp 1 (3 giờ so với 5
giờ), số lượng thao tác ít hơn, các quá trình được tự động hóa cao
(điều khiển trên máy vi tính), mức độ độc hại thấp (không tiếp xúc
với ethidium bromide, tia UV). Điều này giảm thiểu tác động do các
yếu tố khách quan bên ngoài, nâng cao độ tin cậy của kết quả.
Nếu như các kết quả của phương pháp 1 được đánh giá bằng mắt

3. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO
Trong thí nghiệm này, chúng tôi so sánh khả năng định lượng của phương pháp
Real-Time PCR bằng 2 loại hóa chất khác nhau: thuốc nhuộm SYBR Green I (Phương
pháp 1) và mẫu dò Taqman có gắn chất phát quang FAM 490 (Phương pháp 2). Các
kết quả thu nhận được trình bày bên dưới.

Xây dựng đƣờng chuẩn:
Đây là yếu tố quyết định đến kết quả định lượng p35S. Trong cả hai thí nghiệm,
chúng tôi cùng sử dụng các mẫu chuẩn 35S của công ty GeneScan để xây dựng đường
chuẩn. Kết quả như sau:
Trái: Phƣơng pháp 1, Phải: Phƣơng pháp 2
Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phƣơng pháp
Ghi chú:
Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phƣơng pháp
Chu kỳ phát hiện
Mẫu chuẩn
SYBR
Green I
Taqman
Chuẩn 1
Chuẩn 2
Chuẩn 3
22,99
24,32
25,26
26,83
30,04

0,995
527, 0
1,000
94,8

Trong phương pháp 1, chúng tôi còn tiến hành phân tích Melt curve. Kết quả thu nhận như sau: 73
73

Chuẩn 1
Chuẩn 2
Chuẩn 3

Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phƣơng pháp 1

Ghi chú: Từ các kết quả trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
- Hai phương pháp đều có khả năng xây dựng được một đường chuẩn có chất lượng tốt từ các
mẫu chuẩn đã biết trước. Điều này được chứng minh qua các thông số xây dựng đường
chuẩn chúng tôi thu nhận được ở Bảng 4.10.
- Tuy nhiên, phương pháp 2 (Real-time PCR với mẫu dò Taqman) có kết quả dựng đường
chuẩn tốt hơn, thể hiện qua các thông số sau:
Hệ số tương quan của phương pháp 2 cao hơn phương pháp 1 (1,000 so với 0,995)
(Bảng 4.10).
Hiệu quả PCR của phương pháp 2 nằm trong ngưỡng cho phép (90-120 %). Còn
phương pháp 1 vượt ngưỡng, nguyên nhân của vấn đề này sẽ được phân tích sau.

copy tương ứng với số lượng 1 gen đích trong mẫu thí nghiệm

Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phƣơng pháp trong thí nghiệm 3
Mẫu
1 copy
Chu kỳ phát hiện
Kết quả thực tế (copy)
SYBR
Green I
Taqman
SYBR
Green I
Taqman
1
2
27.58
26.18
36,22
35,96
1,28
16,5
1,11
1,38

Nhận xét:
- Các kết quả thu nhận được cho thấy (Bảng 4.11), cả hai phương pháp đều có độ nhạy khá
tốt, có khả năng phát hiện 1 copy gen đích trong mẫu. Tuy nhiên, kết quả định lượng của
phương pháp 1 có sự sai lệch lớn giữa hai lần lặp lại (1,28 copy và 16,5 copy). Điều này có
thể do hiện tượng primer-dimer đã ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Nguyên nhân sự sai
lệch này là do hàm lượng DNA khuông trong phản ứng định lượng quá thấp, dẫn đến số


4. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR
Trong thí nghiệm này, mục tiêu của chúng tôi là đánh giá khả năng định lượng của phương
pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman. Các kết quả thí nghiệm như sau:
Độ nhạy của phƣơng pháp:
Mẫu thí nghiệm: mẫu 1 copy gen đích. 76
76

Chuẩn 1 Chuẩn 2
Chuẩn 3 Chuẩn 4
Mẫu 1 copy 1và 2
Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy

Ghi chú :

Bảng 4.12: Kết quả định lƣợng mẫu 1 copy
Mẫu pha loãng
1 copy
Chu kỳ phát hiện
Kết quả thực tế
(copy)
Lần 1
Lần 2
36,22

gen (%)
Promoter
35S
Gen tham
chiếu
Promoter
35S
Gen tham
chiếu
Lần 1
Lần 2
32,59
28,56
28,93
24,51
200
124
20300
12500
0,985
0,992
Độ lệch

0,007

Nhận xét thí nghiệm định lượng mẫu bắp Bt 176 1%:
- Kết quả định lượng bắp chuyển gen Bt 176 1% (Bảng 4.14) khá tốt. Các kết quả này có sự