78
78

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đối tượng là các mẫu được sàng lọc dương tính với
promoter 35S ở thí nghiệm 2. Các mẫu này được lặp lại 2 lần trong cùng một lần thí nghiệm. Các kết
quả được phân tích trên đồ thị DNA quantification như sau. Hình 4.13: Đồ thị định lƣợng p35S của các mẫu thí nghiệm

Ghi chú:

Hình 4.14: Đƣờng chuẩn phản ứng định lƣợng p35S

Ghi chú: B1 B2 B4 B6
B7 B10 B11
Mẫu chuẩn
Mẫu chưa biết 79
79


80
80

STT
Tên và đặc điểm của mẫu
Kí
hiệu
Chu kỳ phát hiện
Promoter
35S
Gen tham
chiếu

1

2

3

4

5

6

7

Bắp giống 1

Bắp giống 2

34.16
33.46
27.71
27.8
26.05
27.33
24.99
25.81

27.69
27.14
25.6
24.4
23.02
24.23
23.91
23.93
28.32
28.31
24.92
24.92
30.59
27.44

Từ các kết quả trên đây chúng tôi rút ra một số nhận xét sau :
- Nhìn trên đồ thị DNA Quantification ta thấy các mẫu đều dương tính rõ rệt, các đường cong
đồ thị đều vượt lên trên khá rõ so với chu kỳ ngưỡng.
- Hiệu quả của phản ứng : Phản ứng đạt hiệu quả cao với đường chuẩn được xây dựng chính
xác thể hiện qua các thông số như : hệ số tương quan của đường chuẩn đạt 0,998 (định
lượng p35S) và 0,987 (định lượng gen tham chiếu) cao hơn yêu cầu của nhà sản xuất (0,98);

0.06
0.91
0.58
0.39
0.85
0.86
0.01
0.01
0.00
2.23

- Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm trong 2 lần lặp lại là xấp xỉ nhau. Điều này được
thể hiện ở Bảng 4.15 và 4.16 , độ lệch chuẩn của chu kỳ phát hiện là khá thấp, đặc biệt là
một số mẫu như B6, B7, B10.
- Tuy nhiên, nhìn trên đường chuẩn ở Hình 4.14 và 4.16, ta thấy một số mẫu có thể có kết
quả định lượng không chính xác do chúng vượt quá giá trị thấp nhất và cao nhất của các
mẫu chuẩn. Điều này có thể do sự ngoại nhiễm trong thao tác hay chất lượng DNA ly trích
gây ra.
Kết quả định lượng và tỷ lệ phần trăm chuyển gen trong các mẫu theo công thức bên dưới:
%GMO = (Số lƣợng trình tự gen chuyển nạp/Số lƣợng trình tự
gen đối chiếu) x 100
Bảng 4.17: Kết quả định lƣợng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại)
Kí hiệu mẫu
Kết quả định lƣợng (copy)
Tỷ lệ % chuyển
gen (%)
Giá trị trung bình (2 lần lặp lại)

61.09
0.36
11.26
169.56
5347.43 Một số nhận xét được rút ra như sau:
Các mẫu đều có sự hiện diện của p35S trong mẫu. Điều này phù hợp với kết quả
sàng lọc ỏ thí nghiệm trước.
Một số mẫu có sự hiện diện p35S trong mẫu khá thấp (B6: 33,3 copy), một số mẫu
hiện diện p35S rất lớn (B11: 17700 copy, B4: 7880 copy). Điều này có lẽ do sự khác
biệt về nguồn gốc các sản phẩm trong mẫu
Độ lệch chuẩn chu kỳ phát hiện của các mẫu không lớn. Điều này chứng tỏ, kết quả
định lượng không có sự biến động lớn ở các lần lặp lại.
Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm chuyển gen 3 mẫu B1, B2, B4 (đều là hạt giống bắp)
cho thấy sự hiện diện rất chênh lệch số lượng p35S trong các giống bắp khác nhau.
Tuy nhiên, dựa trên cơ sở lý thuyết, chúng tôi cho rằng chỉ có mẫu B1 là có kết quả
định lượng đáng tin cậy.
Mẫu B6 có kết quả định lượng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu nhận được ở
Bảng 4.17, 4.18 và 4.19. Các kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của sản phẩm biến
đổi gen trong bắp trái ăn tươi tại Tp Hồ Chí Minh và phụ cận.
Tương tự, kết quả định lượng ở mẫu B7 cũng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu
nhận được. Mẫu này có nguồn gốc từ các loại bắp được trồng từ giống B1, B2, B4 và
các giống khác, sau đó qua quá trình xay xát tạo nên. Điều này cũng chứng minh có
sự hiện diện của hạt giống bắp chuyển gen tại Việt Nam.
Hai mẫu B10 và B11 có kết quả định lượng p35S vượt quá kết quả định lượng gen
tham chiếu. Điều này có thể do các mẫu này là sản phẩm chế biến, được tạo thành từ
rất nhiều thành phần nguyên liệu khác nhau, nên có thể con số này là tổng số lượng
promoter 35S trong mẫu chứ không chỉ riêng từ bắp chuyển gen. Mặc khác, do bắp

ly trích DNA chuẩn nhằm đảm bảo tốt nhất chất lượng của DNA, đối tương chính
của thí nghiệm này.
Như vậy, tuy phương pháp này đặt ra một số yêu cầu đối với đầu tư trang thiết bị, chuẩn hóa
phòng thí nghiệm, huấn luyện kĩ thuật viên, khả năng ứng dụng thành công phương pháp này tại nước
ta là rất hứa hẹn. 84
84

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận
Vấn đề định lượng sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam còn khá mới mẻ. Trong phạm vi khóa
luận này, chúng tôi chỉ mới bước đầu nghiên cứu về tính khả thi của phương pháp Real-Time PCR
trong việc định lượng DNA. Từ các kết quả thu nhận được, chúng tôi có một số kết luận về quy trình
định lượng các sản phẩm biến đổi gen như sau:
- Bước 1: Ly trích DNA mẫu sản phẩm.
Phương pháp đề nghị: Quy trình 3 (quy trình biến đổi). Tác nhân biến tính màng là
CTAB, biến tính protein là phenol/chloroform, tủa bằng Isopropanol trong điều kiện
lạnh (4
o
C).
Khó khăn: Lượng DNA thu được chưa cao, một số mẫu không ly trích được DNA.
Giải pháp: Thử nghiệm các phương pháp mới, sử dụng bộ kit ly trích.
- Bước 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen dựa trên promoter 35S.
Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.
Khó khăn: Xuất hiện hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu trong một số mẫu.
Giải pháp: Cần tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp.
- Bước 3: Định lượng các sản phẩm biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa

- Tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về định lượng sản phẩm biến đổi gen, tiến đến định
lượng các trình tự đặc hiệu của từng sản phẩm biến đổi gen, như: gen chuyển nạp, trình tự
nối promoter và gen chuyển nạp…nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp định
lượng dựa trên promoter 35S là chỉ có thể định lượng được tổng số thành phần biến đổi gen
trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp.
- Tiến hành nghiên cứu và khảo sát trên số lượng mẫu lớn, các chủng loại mẫu khác
nhau để có tổng kết về tình hình sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam. 86
86

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt

1. Bùi Lan Anh, 2004. Khảo sát qui trình biến nạp gen trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.
cv Samsun). Khóa luận cử nhân khoa học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Việt
Nam, trang 5-12, 16-19.

2. Lê Thanh Bình, 2004. Quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của
chúng. Hội nghị National Workshop on Risk Assessment of GM Crops-VN, tháng 10 năm 2004,
42 slide.

3. Clive James, 2004. Tình trạng cây trồng chuyển gen/cây trồng công nghệ sinh học được trồng
và mua bán trên toàn thế giới trong năm 2004. Báo cáo đánh giá. ISAAA, Mỹ, 14 trang.

4. Cơ quan dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
(ISAAA), 2005. Cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu gần đạt mức tăng trưởng kỉ lục.
ISAAA, Mỹ. 2 trang.


87

13. Bio-Rad, 2005. GMO Testing in Food and Feed: Extraction, Detection and Quantification.
Bio-Rad, American, 8 pages.

14. Bio-Rad, 2005. MyiQ™ Single-Color Real-Time PCR Detection System. Instruction manual,
catalog number 170-9740. Bio-Rad, USA, 133 pages.

15. Bio-Rad. Biotechnology Explorer™ GMO Investigator™ Kit. Bio-Rad, USA, 79 pages.

16. Carolina Roa-Rodríguez, 2003. Promoters used to regulate gene expression. Cambia
Intellectual Property Resource, Australia, p. 1-24, 55-65.

17. Choi Yang Do, Cheong Jong-Joo, 2004. The Current Status of GMOs Development. Crop
Functional Genomics Center, School of Agricultural Biotechnology, Seoul National
University, p 3, 7-17.

18. Clive James, 2004. Biotech crop Countries and Mega-Countries, 2004. ISAAA, USA.

19. Clive James, 2004. Global Adoption rates (%) for pricipal Biotech Crops (Million Hectares).
ISAAA, USA.

20. Clive James, 2004. Global Area of Biotech Crops Million Hectares (1996 to 2004). ISAAA,
USA.

21. Clive James, 2005. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004. ISAAA, 12
pages.

22. Council For Biotechnology Information, 2002. Benefits of Plant Biotechnology. Council For
Biotechnology Information. 54 slides.


30. GeneScan. GMOQuant 35S Screen Corn Kit. Protocol for use of Product cat. No. 5121200610.
GeneScan, Germany, 3 pages.

31. ISAAA. Does the 35S Promoter, which is viral in origin, have any potential to induce new
viruses?. ISAAA, USA, 21 slides.

32. Karudapuram Surekha, and Batey David. Detection of Genetically Modified Soybean in
Processed Foods Using Real-Time Quantitative PCR with SYBR Green I Dye on the DNA
Engine Opticon® 2 System. Application Note Vol.2, No.6, MJ Research, Inc., South San
Francisco, CA, USA, 4 pages.

33. Querci M., Maretti M., Mazzara M., 2004. Qualitative Detection of Mon810, Bt-176 Maize ang
Roundup Ready Soybean by PCR. The Analysis Of Food Samples For The Presence Of
Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.). European
Commission Joint Research Center, EU. p. 12.

34. Querci M., Mazzara M., 2004. Characteristics of the Qualitative PCR Systems Described in the
Manual. The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms
(Querci M., Van den Eede G., Jermini M.). European Commission Joint Research Center, EU.
p. 4.

35. Querci M., Van den Eede G., Jermini M., 2004. Overview, General Introduction on Genetically
Modified Organisms (GMOs), EU legislation. The Analysis Of Food Samples For The
Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.).
European Commission Joint Research Center, EU. p. 3-12, Annex 1.

36. Rogers S.O. and Bendich A.J, 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular
Biology Manual A6, p.1-10.

44. Arne Holst-Jensen, 2001. 2.2 DNA-based methods. CHAPTER 2 GMO detection methods and
validation. A review, with notes on future needs and directions. National Veterinary Institute,
NORWAY
/>ng%20PCR%20review.htm 45. Food and Feed Safety. Community register of GM Food & Feed. 46. Genetic Transcription and Regulation and Control. 47. Harrison Richard. Sequence Detection Systems: Principles of Real-Time PCR and Taqman
Systems, PE Biosustems, Australia and New Zealand. 48. Real-Time PCR. 2004.
90
90

PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Đệm trích 1.
- Tris/HCl 0,05 mol/l
- EDTA 0,05 mol/l
- SDS 30 g/l