Câu 1: : Hãy trình bày khái niệm,cách gọi tên, các kiểu cắt và ứng dụng của enzym giới hạn
*Enzim cắt g/hạn (RE) : là enzim nhận biết trình tự ADN đ/trưng & cắt tại đó lần đtiên đc fát hiện
-Cách gọi tên:
+ Chữ viết hoa đtiên là tên ? giống VK mà RE đc tách chiết
+ 2 chữ kế tiếp ko viết hoa là tên Loài ? VK nói trên
+ Tiếp theo là 1 chữ số la .mã để chỉ TTự nhóm RE (sdụng ʘ T/hợp nhiều RE cùng tìm thấy ở 1 loài
VK)
+ Đôi khi còn thêm 1 chữ viết hoa trước số la mã để chỉ dòng VK
VD: BamHI : enzim đtiên đc tách chiết từ VK Bacillus(giống) , amyloliquèaciens(loài) , dòng H
-Cơ chế hđộng: có 2 kiểu cắt:
+ Cắt tạo đầu bằng: Các RE cắt 2 mạch của ADN tại cùng 1 điểm
VD: HeaIII
5’…….GGCC…… 3’
3’…….CCGG…… 5’
5’… GG CC……3’
3’… CC GG……5’
+ Cắt tạo đầu so le : các RE có vtrí cắt lệch nhau / 2 mạch. ʘ TH này các đầu dính bsung có thể bắt
cặp trở lại
VD: EcoRI
5’……GAATTG……3’
3’……CTTAAC…….5’
- Khả năng biến nạp lớn và dễ biến nạp vào tế bào chủ
- Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần
tìm.
- Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector
 Một số vector tách dòng thường dùng:
- Dựa vào nguồn gốc người ta chia vector tách dòng thành 3 nhóm:
+ Các vector là những plasmid
+Các vector là phage
+ Các vector nhân tạo
- Plasmid thế hệ 2: pBR332 có kích thước 4363bp và 2 gen kháng thuốc, 1 kháng được
compicilline (ampR) và 1 kháng đượcp tetracglline (tetR).
Có số lượng bản sao lớn, thực nghiệm cho thấy , cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong
E.coli. Số lượng này có thể tăng lên từ 1000 đến 3000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
- Các plasmid thế hệ thứ 3: Gồm 3 nhóm lớn
+ Dãy pUC: là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb. Có 2 Operon Lac 2, các
VK chủ yếu sử dụng các pUC dùng để tổng hợp enzym β – galactosidase có vùng polylenker với 13
vùng giới hạn của 13 enzym cắt hạn chế.
+ Plasmid pGEM : kích thước khoảng 3kb, mang gen kkhangs ampicilline(Amp) và vùng
polylinker. Gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzym cắt hạn chế. Hai promoter đặc trưng cho RNA –
plymerase sp6 và T7 ở 2 bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là co phép phiên mã đoạn DNA gắn
trong vector thành nhiều RNA mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò hoặc dùng trong
nghiên cứu cấu trúc, chức năng của RNA.
- Nhóm các plasmid Bluescript: Kích thước khoảng gần 3kb, có 2 promotor là T7 và T3 ở 2 bên
vùng polylinker. Có ưu điểm là mạnh, hay dùng, sản xuất RNA
+Các vector M13: là phage thể sợi, xâm nhiễm đặc trưng E.coli DNA của phage mạch đơn, có
kích thước 6,4 kb . Trong đó có khoảng 10 gen.
+ Các cosmid: là những vector lai nhân tạo từ 1 plasmid với các trình tự cos của phage  . Các
trình tự cos này điều khiển sự đóng góc DNA tái tổ hợp vào đầu của phage, kích thước của cosmid
 5 kb có thể nhận được đoạn cài 35 – 45 kb có thể tới 47kb


B2: Gắn cDNA vào vector
- Ghép nối đầu bằng
- Dùng linker hoặc adapter
- Tạo đuôi homopolymer
B3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ
- Các loại tế bào vật chủ E.coli, nấm men, tảo…
- Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ, hóa biến nạp; và điện biến nạp
 Các bước tách dòng từ DNA
B1: tách DNA, nhân gen
B2: Gắn cDNA vào vector
- Ghép nối đầu bằng
- Dùng linker hoặc adapter
- Tạo đuôi homoppolymer
B3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ
- Các loại Tb vật chủ: E.coli, nấm men, tảo.
- Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào TB vật chủ: hóa biến nạp và điện biến nạp. Câu 4: Đặc điểm của plasmid và ứng dụng của nó trong KTDT. Cách gọi tên plasmid nhân tạo.
 Đặc điểm của plasmid:
- Plasmid là những DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng khép kín, sợi đôi, nằm ngoài NST được tìm thấy

10
TB biến nạp cho 1 mg DNA tái tổ hợp, tuy nhiên lượng TB biến nạp bị chết nhiều
có khi lên đến 70%
Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
+Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại TB khác nhau.
+ Độ dài của hệ số thời gian (thời gian ngắt xung – ms)
+ Nồng độ tế bào chủ
+ Nồng độ DNA tái tổ hợp
+ Giai đoạn phát triển của TB (TB quá già hoặc quá non đều ko thích hợp)
+ Môi trường dung dịch đệm
+ Cấu trúc màng TB  Hóa biến nạp:
- Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen, cũng là công cụ để
thực hiện các thao tác tạo tính DT của vật sống
- Theo Menđen và Higa cho thấy rằng: E.coli trở nên rất dễ dàng biến nạp bởi DNA ngoại lai khi
các TB VK được xử lý trong MT có CaCl
2
và trước đó được sốc nhiệt ở 42
o
C
- Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào
TB chủ.

+ PP thường dùng nhất là PP Southern blot bao gồm các bước:
-Tách DNA bộ gen của TB
-SD enzym cắt giới hạn để cắt phân tử DNA thành những đoạn nhỏ
-Điện di trên gel Agarose để tách những đoạn có kích thước khác nhau
-Gây biến tính DNA trên gel bằng dd NaOH 0,5M
-Chuyển DNA từ gel lên màng lai
-Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ ở nhiệt độ là 65
o
C, thời gian lai khoảng 3 -8h.
Rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dò ko bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng lai
-Chụp và ktra phóng xạ tự ghi
 Phân tích bằng xác định TT nu:
+ PP hóa học của Maxam Gilbert :
- Nguyên tắc : dựa trên PƯHH thủy giải đặc hiệu, các DNA ko tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập
hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
- Kết quả: các PUHH xử lý mạch DNA đc phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamid có thể
xác định đc TT mạch đơn
- Ưu điểm: dễ tiến hành, chi phí thấp
- Nhc điểm: Độ chính xác ko cao, phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót để kết quả gần
đúng nhất.
Ko đưa đc vào tự động hóa

cDNA?
TRẢ LỜI:
(*) Khái niệm ngân hàng hệ gen là:
àoNgân hàng hệ gen của một sinh vật là tập hợp các trình tự DNA cấu thành bộ gen được gắn vào
vector ,nó chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngân hàng này được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tái tổ hợp
cả các chuỗi mã hóa lẫn các chuỗi k mã hóa. Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng bộ gen có thể được
thiết lập bất kỳ loại tb nào of sv nghiên cứu.

(*) Các bước thiết lập ngân hàng hệ gen là:
- Tách và làm sạch DNA of sv
- Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định = enzyme RE loại II- thông thường, người ta sử
dụng EcoRI
- Vector dk chọn để tạo dòng gen thường là cosmid hoặc phage λ cũng dk xử lý bởi EcoRI
- Tạo vector tái tổ hợp và đóng gói trong vỏ phage
- Đưa vector tái hợp và tế bào chủ và tạo dòng
- Xác định đặc tính và biểu hiện của dòng vi khuẩn vừa lập
- Tiến hành sang lọc, nghĩa là phải tách những vector nào có đoạn DNA ưa chuộng, từ đó xây dựng
ngân hàng bộ gen
(*) Ngân hàng cDNA
- Thiết kế ngân hàng cDNA: Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của
một tế bào . Như vậy, ngân hàng dk thiết lập từ một loại tb xác định (tb biệt hóa), vì thế cDNA mang CÁC TẾ BÀO VẬT CHỦ
- Vật chủ nhân sơ: thường sử dụng là vi khuẩn E.coli
Ưu điểm của E.coli: Sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector.
Ngoài ra còn sử dụng một số loại vk như: Bạillus, Pseudomonas, Streptomyes
- VẬt chủ nhân chuẩn: Gồm các tb nấm men , động vật, thực vật : tảo
Ưu điểm của nấm men : dễ nhân giống, có rất nhiều loại tb đột biến
PHƯƠNG PHÁO BIẾN NẠP VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ
a. Điện biến nạp
Nguyên tắc: sd dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng sinh học of tb, tạo dk cho
tb hấp thụ DNA tái tổ hợp dk dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 10
9
đến 10
10
tb biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy nhiên, lượng tb biến nạp
bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối vs các loại tb khác mhau
- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung – ms) . Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết đối vs các
loại tb sv, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt dk khoảng 6ms
- Nồng độ tb chủ
- Giai đoạn phát triển của tb (tb quá già hoặc quá non đều k thích hợp)
- Môi trường dung dịch đệm
- Cấu trúc màng tb
b. Hóa biến nạp
Hiện tg biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cs phân tử of gen, cũng là công cu để thực hiện
các thao tác tạo tính di truyền của vật sống, Theo Mandel và Higa chho thấy rằng, E.coli trở nên rất dễ

DNA tái tổ hợp.
1. SD các cơ chất sinh màu
- SD cơ chất ko màu dùng cho β- galactosidase là X- gal. - Cơ chế:
+ SD vector mang 1 phần gen lacZ, gen này mã hóa cho β- galactosidase
+ Trong MT có lactose (hoặc IPTG) thì enzym này sẽ đc tổng hợp bởi các TB E.coli
+ Nếu β- galactosidase đc tổng hợp sẽ chuyển X-gal thành màu xanh
+ Nếu DNA lạ xen vào gen lacZ thì β- galactosidase ko đc tổng hợp nên X-gal sẽ ko bị phân
giải, tạo khuẩn lạc có màu trắng.
- Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ là những khuẩn lạc có màu trắng. Hệ thống phát hiện X-gal
có thể diễn ra theo 2 cách:
+ 1 gen β- galactosidase nguyên gốc (lacZ) có thể có mặt trong vector
+ Dùng 1 hệ thống bổ trợ mà ở đó 1 phần của gen lacZ có mặt trong vector và phần còn lại thì
có mặt trong TB chủ.
2. Bất hoạt bằng đoạn xen
- KN: Sự có mặt của các đoạn DNA đã tách dòng có thể phát hiện đc nếu đoạn xen xen vào TT
mã hóa của gen
- 3 KT sd PP này:
+ Gắn đoạn DNA cần nhân lên vào giữa 1 trong 2 gen kháng kháng sinh

Câu 10: Trình bày PP tách dòng từ DNA

- B1: Chuẩn bị gen tách dòng và vector tách dòng, nhân gen bằng PCR – tách chiết DNA bộ gen,
nhân gen bằng PCR, SD enzym giới hạn cắt thành các đoạn nhỏ DNA, điện di trên gel agarose
(hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn.
+ Từ KQ điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng để lựa chọn đc DNA cần tách dòng
+ Vector tách dòng: SD plasmid, phage hoặc NST nhân tạo… tùy thuộc vào kích thước của gen
cần tách dòng và mục đích tách dòng.
- B2: Gắn DNA vào vector tạo vector tái tổ hợp
+ SD enzym giới hạn thích hợp cắt các gen cần tách dòng và vector tách dòng ở những vị trí đặc
hiệu giống nhau
+ Có 3 cách:
@ Ghép nối đầu bằng : SD các enzym nối DNA ligase : hiệu quả ko cao.
@ Dùng linker hoặc adapter : gắn thêm các linker hoặc adapter có TT nhận biết của cùng 1
enzym giới hạn vào các đoạn DNA cần tách dòng để tạo ra đầu dinh, có bổ sung thêm ligase
DNA
@ Tạo đuôi homopolymer: dùng enzym terminal tranferase để gắn cùng 1 loại nu vào đoạn
DNA cần tách dòng.
 Nếu có các đầu dính sẵn : khi bổ sung DNA cần tách dòng vào vector thì chúng tự nối lại
với nhau nhờ các TT bổ sung.


-Là các plasmid mạnh và đa năng, tiện SD cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục TT nhận
biết của chúng nối tiếp nhau tạo thành các đoạn dài gọi là polylinker

-Ưu điểm của vector plasmid thế hệ thứ 3 là: phên mã AND thành nhiều ARN:
+ Có kích thc nhỏ, sao chép nhanh trong TB VK
+ Tạo số lượng bản sao lớn
+ Có đặc điểm Origin
+ Có đặc điểm nhận biết RE MSC (Multi cloning sits), vị trí đa tách dòng (polylinker) bằng gen
quy định lên dấu chuẩn chọn lọc.
-
Dấu chuẩn chọn lọc là gen mã hóa enzym β – galactoside. Có chức năng phân hủy X-gal tạo ra
khuẩn lạc màu xanh. Nếu TB vật chủ ko có loại enzym này thì khuẩn lạc màu trắng.

-
Vector plasmid thế hệ 3 còn có 1 gen kháng kháng sinh, có mục đíchCâu 12: TB các PP sàng lọc các dòng DNA tái tổ hợp
- Sàng lọc (Screening): là KT đc dùng khi 1 QT các TB sồng đc phân tích để XĐ các TT mong
muốn. Vì chỉ có 1 phần nhỏ trong số lớn các khuẩn lạc của VK hay các vết tan của phage đem
sàng lọc có mang các đoạn DNA quan tâm nên việc sàng lọc phải có những PP đặc hiệu và độ
nhạy cao.
a) Sàng lọc bằng cách lai axit nu:
- Mẫu dò acid nu : mẫu dò là 1 TT DNA bắt cặp bổ sung với 1 TT DNA đích.Tuy nhiên cũng có
TH sd mẫu dò từ SV thứ 2 để xđ DNA của SV thứ nhất.
- Có 3 loại mẫu dò: cDNA, DNA hệ gen, các Olygonucleotid
 Mẫu dò cDNA: Có thể tạo ra QT và đem sd, ko cần tách dòng các cDNA. KT này thường được SD
dưới tên gọi là PP sàng lọc “cộng/trừ”
+ Nếu dòng ta quan tâm có chứa 1 đoạn chỉ biểu hiện trong những điều kiện xđ thì các mẫu dò có
thể tạo ra từ các QT mRNA của TB biểu hiện gen này và từ các TB ko biểu hiện gen này.

- SD kháng thể đặc hiệu để sàng lọc.
- Coi protein là 1 kháng nguyên
- PP:
+ Tách protein tái tổ hợp từ TB vật chủ
+ Điện di protein
+ SD kháng thể thứ nhất liên kết với protein tái tổ hợp.
+ SD kháng thể thứ hai liên kết với kháng thể thứ nhất
+ Loại bỏ các TP ko liên kết với protein tái tổ hợp.
+ Quan sát dựa vào sự xuất hiện của KT thứ 2.

c)PP sàng lọc bằng PCR
- Các vector đc thiết kế ở 2 đầu cài vào TT gắn với pUC
- Khi PCR với mồi pUC thì kích thc của băng ddienj di sau khi tách dòng sẽ lớn hơn khoảng
200bp so với DNA đã chèn vào.
- Ưu điểm: -Tốn ít thời gian hơn
-Khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng từ thư viện cDNA và genomic DNA.

Cau 13: Nêu các PP gắn đoạn cDNA vào vector
- PP nối đầu bằng:
+ Xử lý, tạo vetor có đầu bằng
+ Nối vào cDNA nhờ enzym ligase
-Phương pháp ghép nối đầu bằng:
-Dùng linker (Adapter) -Tạo đuôi hômpolymer
Chọn vector cần phải chú ý đến những yêu cầu sau:
- Độ lớn của gen lạ (đoạn cài)
- Loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng
- Xử lý vector: cắt vector bằng RE cùng với loại enzym đã cắt DNA nói trên.
- Khử nhóm photphat bằng enzym alkanline photphatase để tránh 2 đầu vector đóng kín trở lại.
B3: Tạo DNA tái tổ hợp
- Tạo bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng 1 enzym cắt hạn chế loại II. Khi đó
chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
- Một phanr ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzym DNA ligase của E.coli hoặc phage T4
hoàn chỉnh phân tử lai.
B4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp
- Mục đích : Sử dụng bệ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành 1 số lượng lớn
hơn bản sao, vận chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào VK tức là làm cho VK trở thành khả biến.
- Phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong
vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hay tải nạp.
- Biến nạp là hiện tượng chuyển VCDT trực tiếp từ tế bào cho D(Doner) sang tế bào nhận
R(Raception), không cần sự tiếp xúc giữa 2 tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage và virus.
- Được thực hiện với các vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid.
B5: Phát hiện dòng cần tìm:
- Tiến hành thí nghiệm trong hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng VK có thể mọc lên theo 3
khả năng:
+ TB VK ko nhận plasmid tái tổ hợp
+TB nhận plasmid nhưng ko có gen lạ
+ TB nhận được plasmid tái tổ hợp
 Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau để xác định
dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò.
Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.