Bộ Y tế
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Tên đề tài

Nghiên cứu quy trình sản xuất
cao đặc hai loài diệp hạ châu
quy mô pilot

Chủ nhiệm đề tài : DS. Nguyễn Văn Phong
Cơ quan chủ trì đề tài : Công ty cổ phần hóa dợc việt nam
M số đề tài: 01/06-10 Nghiên cứu KHCN phát triển nguồn dợc liệu và
thuốc cổ truyền 7267
30/3/2009

Hà Nội, 2008

2
Bộ Y tế

5. Th ký đề tài: KS. DS. Nguyn Mnh Hựng
6. Phó chủ nhiệm đề tài: PGS TS. Lờ Xuõn Qu
7. Danh sách những ngời thực hiện chính
TT H v tờn
1 Hong Vn Ho, CN.
2 Nguyn Minh Lý, CN.
3 Nguyn Vn Thụng, KS.
4 inh Vn Thnh, KS.
5 ng Quc Chn, KS.
6 Phm Vn Khang, ThS.
7 V Anh Tun, Ths.

8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có)
9. Thời gian thực hiện: Từ 1/2007 đến 12/2008 4
Những chữ viết tắt
*)

Viết tắt Nguyên bản Ghi chú
P.a Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
P.u Phyllanthus urinaria L.
DHC

5
Môc lôc
Mục
Trang
Phần A: Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài (chủ nhiệm ĐT tự đánh giá) 8
1. Kết quả nổi bật của đề tài
8
1.1. Đóng góp mới của đề tài 8
1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) 8
1.3. Hiệu quả về kinh tế 9
1.4. Hiệu quả về xã hội 9
1.5. Hiệu quả khác 10
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 10
3. Đánh giá thực hiện ĐT (đối chiếu với ĐCNC được phê duyệt ) 10
(a) Tiến độ 10
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu 10
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương 11
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 11
4. Các ý kiến đề xuất 11
Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 12
1. Đặt vấn đề 12
1.1. Tình hình chung - Tính cấp thiết 12
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài 13
1.3. Mục tiêu nghiên cứu 13
2. Tổng quan đề tài 14
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài 14
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18

o
trong PTN [12,25] 58
4.4.7. Hàm lượng hoạt chất trong DHC đắng 59
4.5. Nghiên cứu DHC (P.u) 60
4.5.1. Định tính thành phần hóa học DHC (P.u) 60
4.5.2. Định lượng một số hoạt chất DHC (P.u) 61
4.6. Bàn luận kết quả nghiên cứu phòng thí nghiệm 61
4.6.1. So sánh định tính thành phần hóa học 61
4.6.2. So sánh định lượng thành phần hóa học hai loài P.a và P.u 62
4.6.3. So sánh hiệu quả chiết của dung môi 63
4.6.4. Bàn luận về quy trình chiết phòng thí nghiệm 64
4.6.5. Lựa chọn dung môi và quy trình chiết pilot 65
4.7. Điều chế cao đặc hai loài P.a và P.u qui mô pilot 66
4.7.1. Kết quả chiết pilot tạo cao đặc 66
4.7.2. Kết quả phân tích kiểm tra cao đặc chiết pilot 67
4.7.3. Bảo quản nghèo oxi hai loài cao đặc p.a và p.u 72
4.8. Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot 74
4.8.1. Nguyên phụ liệu dung môi hoá chất 74
4.8.2. Thiết bị, máy móc 75
4.8.3. An toàn lao động 76

7
4.8.4. Sơ đồ Quy trình sản xuất 77
4.8.5. Mô tả Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC 78
4.8.6. Kiểm tra chất lượng 80
4.8.7. Bã chiết – bảo vệ môi truờng 80
4.8.8. Các hồ sơ và sổ ghi chép cần thiết cho sản xuất cao 81
4.8.9. Quản lý chất lượng 82
4.9. Sản xuất 200 kg cao đặc DHC đắng 83
4.9.1. Nguyên liệu 83


1. Kết quả nổi bật của đề tài
1.1. Đóng góp mới của đề tài
• Đã xác định được không chỉ có 1 loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn (P.a)
duy nhất. Nước ta có ít nhất 2 phân loài (giống) P.a
• Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng
• Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Lignan
• Đã xây dựng được Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot
• Đã áp dụng phươ
ng pháp bảo quản chống oxy hóa, kín khí nghèo oxy, cho
bảo quản dược liệu và cao đặc DHC đắng

1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể)
* Về xác định tiêu chuẩn hóa dược liệu
Thu thập đ ược dược liệu DHC tại các địa điểm Thái Nguyên, Bắc Giang, Cát
Bà, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Yên Bài , phân biệt được loài P.a và loài P.u.
* Về thành phần hóa học
Đã định lượng ba nhóm chất chính là Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong
cây và trong cao đặc hai loài DHC.

* Về Quy trình sản xuất
Đã xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, hàm luợng
Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cao thành phẩm đạt TCCS.
* Về bao gói bảo quản
Đã bảo quản thử nghiệm trong điều kiện nghèo oxy cho dược liệu và cao
đặc thành phẩm, đạt chất lượng và kéo dài được thời gian lưu kho.

9
* Về xây dựng thương hiệu
Đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu DHC đắng, tiêu chuẩn chất lượng cao


1.5. Hiệu quả khác
• Góp phần phát triển ngành công nghệ hóa dược
• T
ừng bước đưa công nghệ sản xuất có tính công nghiệp trong việc khai
thác nguồn thảo mộc cho đông dược.

2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
• Đã phối hợp với công ty dược phẩm Đà Nẵng bào chế thuốc điều trị bệnh
gan từ cao đặc DHC đắng sản xuất tại CTCP Hóa Dược Việt Nam.
• Một phần nhỏ s
ản phẩm cao đặc DHC đắng đã được sử dụng trực tiếp
không cần bào chế, thay thế cho việc ‘sắc’ thuốc truyền thống hay ‘hãm’
chè từ DHC khô.

3. Đánh giá thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt
(a) Tiến độ: Đúng theo tiến độ
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra
(c) Các sản phẩ
m tạo ra so với dự kiến của bản đề cương
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương
• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương
• Khối lượng cao đặc sản xuất được vượt nhiều lần so với dự kiến.

11
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Kinh phí đã được thực hiện theo định mức, nội dung và đối tượng
chi như đã được phê duyệt trong đề cương, đã thanh quyết toán xong.


1.1. Tình hình chung – tính cấp thiết
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có hệ thực vật rất
phong phú, đa dạng, với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài đã được
nhân dân ta dùng làm thuốc [3, 4], là nguồn tài nguyên thiên nhiên quí báu,
nguồn gen vô giá không phải quốc gia nào cũng có.
Hệ thực vật phong phú là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp
chất thiên nhiên ở nước ta, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho ngành hóa dược
đang trên đà phát triển.
Các phương thuốc y học cổ truyền, các nguồn đông dược có những ưu thế
nhất định, đối với nhiều lĩnh vực y tế có tính vượt trội cao, nhất là độc tính thấp,
hiếm khi có tác dụng không mong muốn, và dễ sử dụng. Nguồn tài nguyên sinh
học này có thể tái tạo tự nhiên hay nhân giống và sinh khối nhân tạo, không gây
ô nhiễm môi trường, không làm tổn hại đến môi sinh. Hiện có tới 60%-70% các
loại thuốc chữ
a bệnh đang lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm
sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [3].
DHC là một cây thuốc quí, được nhiều nước trên thế giới sử dụng, ngày
càng đuợc quan tâm nghiên cứu. DHC có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan,
làm phục hồi chức năng gan và ức chế virus viêm gan B phát triển. Nhiều chế
phẩm bào chế từ DHC đã được lưu hành ở
nước ta, thay thế một phần thuốc nhập
đắt tiền, mang lại lợi ích hết sức thiết thực về y tế, xã hội, và đặc biệt về kinh tế
cho bệnh nhân bị bệnh gan ở nông thôn.
Tuy nhiên việc sản xuất thuốc còn phụ thuộc thời vụ thu hái, việc chế biến
nguyên liệu, bào chế bán thành phẩm còn thủ công, nhỏ lẻ, chất lượng sản phẩm
chưa ổn
định.

13
Để sản xuất qui mô lớn, có tính công nghiệp, cần có nguồn nguyên liệu ổn

14
2. Tæng quan ®Ò tµi
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài
2.1.1. Nghiên cứu về DHC
DHC là cây thuốc tự nhiên, nên chỉ quốc gia nào có nguồn tài nguyên này
mới có quá trình sử dụng lâu đời. Các nước nghiên cứu về DHC đều có nguồn
nguyên liệu DHC tự nhiên, điển hình nhất là Ấn Độ, một số nước Nam Mỹ,
Trung Quốc … Trong số đó, Ấn Độ là nước có nhiều kết quả ứng dụng Diệp hạ
châu, và có những nghiên cứu cơ bản có hệ thống. Ngoài ra một số nước phát
triển như Mỹ, Nhật, Pháp mới đây đều có những công trình nghiên cứu về Diệp
hạ châu theo phương pháp của y học hiện đại.

2.1.1.1. Về thực vật học
DHC từ lâu được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước : Trung Quốc, Ấn độ, các
nước Nam Mỹ (Peru, Achentina, ). Trên thế giới đã phát hiện trên 700 loài Diệp hạ
châu, với tên gọi dân gian rất khác nhau, nhưng trong số được nghiên cứu nhiều nhất
vẫn là hai loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn. và Phyllanthus urinaria L.
Có thể liệt kê một số tài liệu khoa học nghiên cứu về hai loài DHC này:
1. Nghiên cứu về loài Phyllanthus urinaria L. [28, 34, 37, 38, 50]
2. Nghiên cứu về loài Phyllanthus amarus
Schum. et Thonn. [25, 29, 33, 36, 41, 42,
49, 59, 62].
Ngoài ra còn có một số loài khác được nghiên cứu:
3. Nghiên cứu về loài Phyllanthus niruri [46, 48, 50, 67]
4. Nghiên cứu về loài khác (Phyllanthus acidus [55], (Phyllanthus emblica-) [52])
5. Nghiên cứu về Phyllanthus, không phân biệt loài nào [63, 69, 70] cho thấy

15
khả năng sử dụng hỗn hợp các loài Diệp hạ châu.
2.1.1.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

59, 62, 66, 67]
c/ Điều hòa đường huyết, lợi tiểu, hạ huyết áp [43, 51, 53, 56]
d/ Tác dụng bảo vệ hệ tim mạch [38, 50, 52]
đ/ Tác dụng chống ung thư (anticancer-cytotoxicity), chống HIV, [30, 45, 54]

2.1.1.4. Kết quả nghiên cứu về độc tính
Trong suốt thời gian hơn 30 năm nghiên cứu và sử dụng DHC để điều rị
bệnh, trên thế giới chưa ghi nhận trường hợp ngộ độc nào.

2.1.2. Một số chế phẩm từ DHC của nước ngoài
1. Sản phẩm từ DHC: bột lá, hạt (seeds), dịch cồn (tinture). Bột lá khô 5g
pha nước nóng uống (như pha chè) http://www.tropilab.com/shatterst.html

2. CT ChromaDex (www.chromadex.com
) sản phẩm Phyllanthin và
hypophyllantin, Quercetin (5mg, 10mg)
3. CT Pharmasave: Bột DHC 200mg/lần, 3 lần/ngày, điều trị bệnh gan, kể cả
u gan (http://www.nhiondemand.com/)
4. Live 52 của Ấn Độ,

2.1.3. Chiết Diệp hạ châu
Chiết DHC được thực hiện chủ yếu với dung môi nước, tiếp theo là

17
dung mụi cn/nc. Quy trỡnh chit DHC c gii thiu trong hỡnh 1.3:
* Thu hỏi: cú th chit ngay tt c cỏc b phn ca cõy thu hoch c, hoc
chit tng b phn riờng bit, c bit l lỏ, thõn cõy.
* X lý s ch: Cú th x lý sn phm thu hỏi trc khi chit, vớ d phi sy
khụ, ct hoc xay nghin nh. Vớ d chit 10kg nguyờn liu / 100 lớt nc.
* Chit: chit truy

kho
ảng hơn 700 loài, phân bố khắp nơi đặc biệt tập trung ở vùng Đông Nam Á
và vùng nhiệt đới của Nam Mỹ. Hai loài DHC được quan tâm nghiên cứu nhiều
nhất là [6-10, 13-18, 20. 24. 26]:
1. Cây Diệp hạ châu (cây chó đẻ răng cưa) không có vị đắng, có tên khoa
học là Phyllanthus urinaria L., được dân gian sử dụng làm thuốc chữa nhiều
loại bệnh và được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [8, 20, 60, 61].
2. Cây DHC đắng có tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum. et
Thonn. mọc hoang phổ biến ở n
ước ta và nhiều nước khác trên thế giới, được sử
dụng để chữa đinh râu, mụn nhọt, lở loét, rắn cắn…, và đặc biệt là thuốc chữa
viêm gan có hiệu quả, được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [8, 9, 10, 13, 15,
18, 24, 26, 60, 61].
Hai cây thuốc quí này là đối tượng nghiên cứu chế tạo cao đặc qui mô pilot.
2.2.1.1. Về thực vật học
Những nghiên cứu mới đây về mặt thực vật học hai loài cây trên được tóm tắt
trong bảng 1.1 [5, 6, 7, 17, 47, 61]. Ngoài ra các đặc điểm khác nhau về thân, lá, hoa
và quả [8, 14, 16, 61], có mô tả chi tiết kèm theo ảnh minh hoạ (hình 1.1) [61].

19

a/ DHC Phyllanthus urinaria L

b/ DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
Hình 1.1. Ảnh hai loài Diệp hạ châu

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của hai loại cây DHC [61].

- Chiết được polyphenol bằng hỗn hợp dung môi CHCl
3
-EtOAc-HCOOH
(7:3:1)
Các chất Alcaloid của DHC đắng (P. a) được nghiên cứu và giới thiệu
trong [24]. Viện Dược liệu chế tạo Phyllantin từ bột cao khô DHC [9]. Các hợp
chất Lignan được chiết xuất và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [60]. 21Hình 1.2. Hypophyllanthin và Phyllanthin

2.2.1.3. Tác dụng sinh học
[9, 10, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26, 61]
DHC có tác dụng sinh học rất đa dạng.
Hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất từ DHC đã chứng minh [14]
+ Chống oxi hoá (phương pháp DPPH) (Hypophyllantin và Phyllantin)
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật (8 chủng điển hình, trong đó có Escherichia
coli) tác động của Hypophyllantin, Phyllantin được so sánh với penicilin.
+ Sử dụng 3 chủng vi sinh để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
hai chất trên, Hypophyllantin và Phyllanthin đều có khả năng chống oxi
hoá, kháng khuẩn 3 chủng E. coli, B. subtilis
và S. cerevisiae
- Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity), đối với tế bào Caco2 (human
colonic carcinoma cell line- Abcam) cho thấy Alcaloid chiết từ DHC có
tác dụng dương tính trên tế bào Caco2 [24, 61]
- Một số nghiên cứu khả năng bảo vệ khôi phục chức năng gan [9, 15, 26]:


sinh hoá, huyết học và tổ chức học [9].
Kết qủa nghiên cứu này phù hợp với kết quả công bố trên thế giới. 23
2.2.2. Chế phẩm từ DHC
1. Hemaparin (XN dược COPHAVINA sản xuất [10, 18]
2. Phyllanthin (Viện dược liệu) [9, 21]
3. Viên bao phim VG-5 (CTCP Dược DANAPHA), Sylgan-S
4. Viên BOBINA, Viên nang Hamega (CT Dược thảo Phúc Vinh)
5. Liver 94 (Viện 103 và Bệnh viện Thanh Nhàn, Hà Nội)
6. Bột DHC đắng- hepaphyl, [Bệnh viện Quân khu IV và XN Dược phẩm
Trung ương),
7. Trà DHC (Viện dược liệu,), DHC (CTCP Dược phẩm 2/9)
8. Viên bao phim LIVSIN-94 (Nhà sản xuất HATAPHAR)
9. Sirô ORALLIVER (CTCP Dược phẩm Hà Tây),

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1. Thiết kế nghiên cứu
Đề tài được thiết kế nghiên cứu xây dựng và triển khai Quy trình sản xuất
cao đặc DHC ở mức pilot.

3.2. Mẫu và đối tượng nghiên cứu
Cây DHC đắng (P.a) và DHC (P.u) là đối tượng nghiên cứu của đề tài. Cả
hai loài DHC này đều được lựa chọn theo kết quả đánh giá về thực vật học.
Mẫu cây DHC được khảo sát tại nhiều vùng (Bắc Giang, Hải Dương, Thái
Nguyên, Thái Bình, Hà Nội, Yên Bái, Hải Phòng, Cát Bà …), được thu hái tự
nhiên. Phần lớn DHC khô làm nguyên liệu sản xuất được thu mua trong dân. Các

24

3.3.2.3. Phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học của DHC
Cả hai phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học chủ yếu
đều dựa theo tài liệu [12, 22].
*) Định tính: Phương pháp định tính theo tài liệu [12, 22], các chất :
Alcaloid,
Coumarin, Dầu béo, Đường khử, Flavonoid, Protit, Saponin, Tanin, Xianua.
Một số ví dụ định tính nhóm hoạt chất
+ Định tính Alcaloid
a) Lấy 50 ml dịch chiết DHC, kiềm hóa bằng 10ml dung dịch NH
3
(20-
25%). Tiếp tục rót vào khoảng 50 ml CHCl
3
lắc mạnh và để cho phân lớp, dịch
chiết được lọc và chuyển vào phễu chiết, thêm vào phễu chiết 10 ml dd HCl
10%. Hỗn hợp được lắc đều cẩn thận rồi để yên trong vài phút. Lớp cloroform
tách ra còn lại lớp axit. Lấy phần axit để thử định tính bằng các thuốc thử sau:
b) Thuốc thử Dragendorff. Cho vài giọt thuốc thử trên vào dịch cần
nghiên cứu thấy có kết tủa vàng cam.
c) Thuốc thử Wagner. Cho vài giọt thu
ốc thử trên vào dịch cần nghiên
cứu thấy có kết tủa mầu nâu.
d) Cho vài giọt axit picric trong cồn vào dịch, thấy cho kết tủa màu vàng.

+ Định tính Flavonoid
a) Phản ứng với amoniac.
Nhỏ 2 giọt dịch thử lên miếng giấy lọc sau đó hơ trên miệng ống nghiệm
đựng dung dịch amoniac thấy xuất hiện màu vàng và đậm dần.
b) FeCl
3