BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI VÀ QUY
TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG KÝ
SINH SÂU HẠI

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ii
MỤC LỤC

Danh mục các bảng viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục hình ảnh vii
Lời nói ñầu 1
CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC
1.1. Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng 2
1.1.1. Biện pháp hoá học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những
năm ñầu thế của thế kỷ XX 2
1.1.2. Hạn chế của thuốc hoá học và vai trò của biện pháp sinh học trong
BVTV vào thập kỷ 80 – 90 thế kỷ XX 3
1.2. ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của công nghệ sinh

3.5.1. Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL 27
3.5.2. Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs 28
3.5.3. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại 29
CHƯƠNG 4: CÔNG NGHỆ NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG
4.1. Lựa chọn công nghệ thích hợp 31
4.2. Công nghệ nhân nuôi in vivo 33
4.2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 34
4.2.2. Thu hoạch tuyến trùng IJs 35
4.2.3. Chuẩn bị cho bảo quản 37
4.3. Công nghệ nhân nuôi in vitro 37
4.3.1. Phân lập VKCS 38
4.3.2. Chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng 39
4.3.3. Chuẩn bị dụng cụ nhân nuôi 40

iv
4.3.4. Gây nhiễm vi khuẩn 40
4.3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp(monoxenic) 41
4.3.6. Thu hoạch IJs 42
4.3.7. Xử lý sự cố 42
4.3.8. Bảo quản IJs 44
CHƯƠNG 5: HIỆU LỰC PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG
EPN
5.1. Cơ sở ñánh giá hiệu lực gây chết của các chủng EPN 46
5.2. Hiệu lực gây chết của một số chủng EPN trong ñiều kiện phòng thí
nghiệm 47
5.2.1. Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S_TK10 47
5.2.2. Hiệu lực phòng trừ sâu của S-TX1 50
5.2.3. Hiệu lực gây chết của chủng H-MP11 51
5.2.4. Hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 53
CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Thời gian sinh trưởng và phát triển của 4 chủng EPN
Bảng 3.2: Danh sách các loài vi khuẩn cộng sinh với EPN
Bảng 5.1: Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S-TK10
Bảng 5.2: Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10
Bảng 5.3: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng S-TK10
Bảng 5.4: Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S-TX1
Bảng 5.5: Hiệu lực gây chết sâu xanh của H-MP11
Bảng 5.6: Hiệu lực diệt sâu xanh da láng của H-MP11
Bảng 5.7: Hiệu lực gây chết sâu keo da láng ở chủng H-NT3
Bảng 5.8: Hiệu lực gây nhiễm sâu xám của chủng H-NT3
Bảng 5.9: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng H-TN3


vỡ, sâu hại ngày càng kháng lại thuốc, môi trường ñất và nước ô nhiễm nặng
nề nhưng ñáng lo ngại hơn là vấn ñề tồn lưu thuốc trong sản phẩm nông
nghiệp và ñộng vật ăn chúng gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sức khoẻ con
người. Trước yêu cầu bức thiết ñó các nhà khoa học ñã không ngừng nghiên
cứu tìm kiếm một phương pháp phòng trừ hiệu quả mà không gây nguy hại
cho môi trường và sức khoẻ con người. Chính vì vậy mà phương pháp bảo vệ
thực vật bằng biện pháp sinh học ñã ra ñời.
Trong số các tác nhân sinh học dùng trong ñấu tranh sinh học thì tuyến
trùng ñược ñánh giá cao vì phổ ký chủ rộng, có thể sử dụng phòng trừ nhiều
loài sâu hại. Nhiều nghiên cứu về tuyến trùng ñã ñược tiến hành ở Việt Nam,
quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng cũng ñược thử nghiệm. Chế phẩm
tuyến trùng có thể hoạt ñộng tốt trên ñồng ruộng ñể phòng trừ sâu hại. Xuất
phát từ thực tiễn trên, sinh viên tiến hành “tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu
hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại” nhằm
ứng dụng công nghệ sinh học ñể mở rộng chế phẩm này trong sản xuất, bảo
vệ cây trồng.

Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
2
CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC

1.1. Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây
trồng
1.1.1. Biện pháp hoá học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những
năm ñầu thế của thế kỷ XX
Những năm ñầu của thế kỷ XX, ngành hoá học trong bảo vệ thực vật ñã

cũng ñể lại dư lượng hoá chất trong nông sản thực phẩm.
ðiều tra trên các cây trồng nông - ngư nghiệp, các nhà khoa học ñã phát
hiện thấy trên 500 loài sâu, nhện hại mang tính kháng thuốc, các quần thể con
trùng kí sinh, thiên ñịch có ích như các loài ăn thịt và bắt mồi tự nhiên ñã bị
giảm hẳn số lượng. Ong bướm thụ phấn hoa ñã bị tiêu diệt khá nhiều, ñiều
này ñã gây ảnh hưởng lớn ñến năng suất cây trồng, ñặt biệt là các loài con
trùng thụ phấn chéo, các loài giun và côn trùng trong lớp ñất cũng ngày một ít
ñi rõ rệt, các loài chim thú ăn sâu cũng dần dần biến mất, có khi bị cạn kiệt.
Chính vì vậy, vai trò của các biện pháp sinh học trong ñấu tranh sinh học
ñã ñược các nhà khoa học trong những năm 80 – 90 của thế kỷ XX ñánh giá
cao khi mà biện pháp hoa học ñã bộc lộ những hạn chế chính như sau :
- Thuốc hoá học ñã tác ñộng lên hệ côn trùng ký sinh và ăn thịt manh
hơn nhiều so với ñối tượng sâu hại cần phòng trừ.
- Thuốc tích tụ trong các cơ thể ñộng vật, thực vật thông qua chuỗi mắt
xích thức ăn, thuốc còn ñọng lại cả trên ñất, nước mà cá, tôm ñã ăn phải con
người lại ăn cả những loài cá, tôm trên.
Liều lượng thuốc trừ sâu cứ tăng dần nên dẫn ñến môi trường sinh thái
ảnh hưởng, sức khoẻ con người bị giảm sút.
- Việc sử dụng liên tục một loại thuốc ñã gây cho những cá thể bị biến
ñổi khả năng chụi ñựng cao với thuốc trừ sâu làm cho sâu hai nhờn thuốc.
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
4
1.2. ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của công nghệ
sinh học trong BVTV
1.2.1. Khái niệm về ñấu tranh sinh học
Theo tài liệu của Hoàng ðức Nhuận thì có rất nhiều ñịnh nghĩa về ñấu
tranh sinh học, nhưng ñịnh nghĩa ñơn giản và dễ hiểu hơn cả là :« ñấu tranh
sinh học là biện pháp sử dụng sinh vật hoặc các sản phẩm của chúng nhằm
ngăn chặn, hoặc làm giảm bớt những thiệt hại do các sinh vật hai gây ra ».

ñể phòng trừ trên cơ sở công nghệ sinh học.
1.2.3. Các nhóm vi sinh vật có ích trong ðTSH
- Nhóm bắt mồi ăn thịt như bọ rùa, bọ mắt vàng, kiến vàng, bọ ñuôi
kìm,
- Nhóm côn trùng và nhện ký sinh: ong mắt ñỏ, ong ký sinh…
- Nhóm vi sinh vật bao gồm vi khuẩn Bt, Virus (NPV, GV, CPV, )vì
nấm Beauveria, Metarhizum, Nomuraea,tuyến trùng…
Ở mỗi nhóm sinh vật có ích ñều phát huy vai trò và tác dụng to lớn trong
ñấu tranh sinh học, ñặc biệt là trong việc phòng trừ các loài thiên ñịch hại
nguy hiểm trên các cây trồng nôn, lâm nghiệp. (Trích dẫn theo Phạm Thị
Thuỳ, 2010)
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
6
CHƯƠNG 2: NHỮNG THÀNH TỰU CƠ BẢN CỦA BIỆN PHÁP ðẤU
TRANH SINH HỌC

2.1. Các hướng chính của ñấu tranh sinh học:
Theo Phạm Thị Thùy (2010, biện pháp ñấu tranh sinh học có những
hướng chính sau):
2.1.1. Nâng cao khả năng hoạt ñộng của các sinh vật có ích ngoài tự nhiên

Trong hai hướng trên, hiện nay các nhà khoa học ñặc biệc chú ý ñến
hướng thứ hai, bởi hướng này hầu hết phải dựa trên nền tảng của công nghệ
sinh học mới có thể phát triển sản xuất ra các loại thuốc trừ sâu sinh học ñạt
chất lượng cao, mang tính ổn ñịnh ñể sử dụng rộng rãi trong phòng trử dịch
hại cây nông, lâm nghiệp.
ðến nay, trên thế giới ñã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về
CNSH trong bảo vệ thực vật, nhiều nước ñã thu ñược những kết quả tốt trong
quá trình triển khai ứng dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại, ,bệnh
hại cỏ dại và chuột hai bảo vệ cây trồng.
2.3. Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho phòng trừ sâu bệnh tại Việt
Nam
Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT, trong danh mục các loại thuốc BVTV
có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học ñược
công nhận cho ñăng ký. ðến năm 2005 ñã có 57 sản phẩm các lọai, ñến 6
tháng ñầu năm 2007 có 193 sản phẩm ñược cấp giấy phép ñăng ký. Nâng tổng
số có 479 sản phẩm sinh học ñược phép lưu hành, trong ñó có 300 lọai thuốc
trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh. Các sản phẩm này ñã góp phần không
nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
8
cơ ñộc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng ñến sức
khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường. Một số sản phẩm tiêu biểu:
+ Nguồn gốc thảo mộc:
- Các sản phẩm chế biến từ cây Neem hiện nay ñã ñược ñưa vào ứng
dụng rộng rãi trong công tác bảo vệ thực vật, ñược chiết xuất từ nhân hạt
Neem ( Azadirachta indica A. Juss ) có chứa hoạt chất Azadirachtin, có hiệu
lực phòng trừ nhiều loài sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công
nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng. Loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc này không
tạo nên tính kháng của dịch hại, không ảnh hưởng ñến thiên ñịch và không ñể

kích thích tính kháng bệnh cháy lá lúa (ñạo ôn) do nấm Pyricularia gây ra.
+ Nguồn gốc nấm: ðiều chế từ nấm có sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học
VIBAMEC với hoạt chất Abamectin ñược phân lập từ quá trình lên men nấm
Steptomyces avermitilis. Diệt trừ ñược các lọai sâu như sâu vẽ bùa, nhện, sâu
tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngòai ra cũng trong nhóm này Vivadamy,
Vanicide, Vali… có họat chất là Validamycin A, ñược chiết xuất từ nấm men
Streptomyces hygroscopius var. jingangiesis. ðây là nhóm thuốc trừ bệnh có
nguồn gốc kháng sinh ñặc trị các bệnh ñốm vằn trên lúa, bệnh nấm hồng trên
cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, bông vải….
- Hai chế phẩm nấm trừ côn trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria
bassiana là sản phẩm của ñề tài do Viện Lúa ñồng bằng sông Cửu Long thực
hiện: Ometar - Metarhizium anisopliae (nấm xanh); Biovip = Beauveria
bassiana (nấm trắng).
+ Nguồn gốc virus: Tiêu biểu là nhóm sản phẩm chiết xuất từ virus
Nucleopolyhedrosisvirus (NPV). ðây là lọai virus có tính rất chuyên biệt, chỉ
lây nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) rất hiệu quả trên
một số cây trồng như bông, ñậu ñỗ, ngô, hành, nho …
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
10
+ Pheromone: Là một nhóm chế phẩm sinh học có tác dụng dẫn dụ giới
tính, ñược sử dụng rộng rãi trong hệ thống bảo vệ thực vật cây trồng. Với ñặc
ñiểm chuyên tính cao với từng lọai sâu hại nên rất an tòan với sản phẩm, sinh
vật có ích và môi trường. Pheromone ñược dùng như một công cụ có hiệu quả
Ở Việt nam hiện nay, việc ứng dụng pheromone ñược tập trung ñối với một
số côn trùng sau ñây:
- Côn trùng hại rau: Các lọai sâu ăn lá: sâu tơ ( Plutella xylostella) , sâu
xanh ( Helicoverpa armigera ), sâu khoang ( Spodoptera litura ) và sâu xanh
da láng ( Spodoptera exigua )
- Côn trùng hại cây ăn trái: tập trung là chất dẫn dụ ruồi vàng ñục

hại sống trong ñất, hoặc những côn trùng phải qua một phần vòng ñời hay
một vùng sinh thái trên ñất.
Khi tiếp cận vật chủ, tuyến trùng thường sâm nhập qua miệng, hậu môn,
lổ thở, tuyến tơ, hoặc nơi có lớp kitin mỏng.
Xâm nhập vào vật chủ tuyến trùng giải phóng ra vi khuẩn cộng sinh,
những vi khuẩn này ñược nhân lên nhanh chóng và chính những chất ñộc của
chúng là nguyên nhân gây chết côn trùng trong vòng 48 giờ.(Trích dẫn theo
Phạm Thị Thuỳ, )
3.1.2. Phân loại
Trong tự nhiên, nhiều loài tuyến trùng có mối quan hệ với các loài côn
trùng ở những mức ñộ khác nhau. Trong số tuyến trùng ký sinh côn trùng,
nhiều loài tuyến trùng có thể gây hại cho côn trùng và trở thành thiên ñịch của
nhiều loài côn trùng sâu hại. Nhóm tuyến trùng ký sinh côn trùng bao gồm ký
sinh tạm thời (facultative) và ký sinh bắt buộc (obligate). Trong số các nhóm
tuyến trùng ký sinh này thì các loài thuộc giống Heterorhabditis vừa có khả
năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh và giết chết côn trùng nên chúng
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
12
ñược gọi chung là nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
(Entomopathogenic Nematodes – EPN).
Trong tổng số gần 70 loài EPN thì có 14 loài thuộc giống
Heterorhabditis ñược phát hiện và mô tả thì có 3 loài có diện phân bố tương
ñối rộng là H.bacteriophora, H.indica, H.megidis. Các loài này ñược tìm thấy
ở nhiều vùng khí hậu ôn ñới, nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của Châu Á, Châu Âu
và Châu Mỹ. Như vậy phần lớn các loài EPN có diện phân bố rất hẹp.
Dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ họ hang và tiến hoá của nhiều ñại
diện tuyến trùng, De Ley & Blaxter, 2002 ñã xây dựng hệ thống phân loại
tuyến trùng mới, trong ñó tuyến ký sinh trùng gây bệnh côn trùng ñược sắp
xếp như sau:

bởi tác ñộng môi trường bên ngoài ñến quá trình xâm nhiễm. Tuy nhiên ở
ngoài ñồng ruộng EPN tấn công vào phổ kí chủ hẹp hơn so với trong phòng
thí nghiệm. Bởi vì tuyến trùng này thích sống trên ñất, kí chủ chính là con
trùng sống trong ñất và hoạt ñộng mạnh trên các loài thuộc bộ cánh vẩy (dẫn
theo Phạm Thị Mến, 2009). Việc phân phân lập loài giống tuyến trùng thường
dựa vào ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella, và do ñó, phổ kí chủ
ñược biết ñến của tuyến trùng ñều thiên về những côn trùng thuộc bộ cách
vẩy. Tuy nhiên, nhiều loài tuyến trùng ñược phân lập từ xác chết ngoài ñồng
ruộng thì có phổ kí chủ giới hạn như S. kushidai và S. carabaei thích nghi với
ấu trùng bọ hung. S. Scapterosci thích nghi với dế dũi và tấn công kèm với
những côn trùng khác, nhưng (Bonifassi và cs 1999) ñã chứng minh sự kết
hợp của Xenorhabdus dòng UY61 và S. scapterisci dễ dàng tấn công G.
mellonella (Hazir và cs,2004).
3.2. Cơ chế xâm nhập, ký sinh và gây bệnh của tuyến trùng EPN
3.2.1. ðặc tính sinh học của tuyến trùng EPN
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
14
Mặc dù các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống
Steinernema và Heterorhabdits là những loài ký sinh bắt buộc ở côn trùng,
nhưng chúng lại có một pha chuyên hoá tồn tại bên ngoài vật chủ côn trùng,
thường là môi trường ñất, ñó là IJs ấu trùng tuổi 3, còn gọi là ấu trùng xâm
nhiễm (infective junveniles), là giai ñoạn ñặc biệt trong vòng ñời phát triển
của nhóm tuyến trùng này. Ở giai ñoạn này, chúng không cần dinh dưỡng
nhưng vẫn có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường ñất khi chưa gặp vật
chủ. Thực chất ñây là giai ñoạn ấu trùng nằm chờ trong ñất và sẵn sàng xâm
nhập vào vật chủ thích hợp ñể ký sinh gây bệnh.
Mỗi giai ñoạn ấu trùng mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn
cộng sinh (VKCS) chuyên hoá. ðối với các loài tuyến trùng Sternernema thì
vi khuẩn cộng thuộc giống Xennohabdus, ở IJs phần trước của ruột, phía sau

trong vòng 48h. Giai ñoạn ñầu trong cơ thể côn trùng IJs cũng ñược phát triển
nhanh chóng ñạt ñến giai ñoạn trưởng thành thê hệ 1.
Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối
giữa ñực và cái, trứng con cái ñược thụ tinh với tinh trùng của con ñực. ðiều
này cũng có nghĩa là ñể sinh sản ñược trong cơ thể côn trùng vật chủ tuyến
trùng cần xâm nhập cả IJs ñực và IJs cái, ñể chúng thâm nhập cả ñực và cái
trưởng thành cho phép chúng có ñiều kiện ghép ñôi trong vật chủ. Một số
nghiên cứu của Gfinfinet at .(2001) cho biết có chủng Steinernema ñược phân
lập ở Indonesea khi nhiễm vào côn trùng vật chủ có khả năng phát triển thành
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết
16
con cái lưỡng tính tự thụ tinh có kích thước lớn. Trong quần thể thế hệ 1 của
chúng cũng có con ñực nhưng số lượng con ñực rất ít.

Hình 3.2: Chu trình xâm nhập và phát triển của EPN bên trong cơ thể
của côn trùng vật chủ
Ở giai ñoạn ñầu con cái ñẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở thành
ấu trùng tuổi hai, tuy nhiên khi già hơn các con cái này không ñẻ trứng mà
trứng ñược giữ lại và nở ra ở ấu trùng tuổi hai ngay bên trong cơ thể con cái.
Mỗi con cái như thế chứa tới hàng trăm ấu trùng bên trong.
Các ấu trùng của thể hệ 1 không phát tán ra ngoài mà ở lại bên trong các
xác chết cơ thể vật chủ ñể sử dụng các chất dinh dưỡng chính bằng các mô
của côn trùng vật chủ ñể phát triển và ñạt ñến nhanh chóng giai ñoạn trưởng
thành giai ñoạn hai. Trong trường hợp xác chết vật chủ vẩn còn nguồn thức ăn
thì chúng vẩn tiếp tục giao phối và phát triển qua thế hệ ba thậm chí thế hệ
bốn bên trong cơ thể vật chủ. Cuối cùng chúng dừng lại ở thế hệ hai khi xác
chết ñã cạn nguồn dinh dưỡng và chúng bắt ñầu chui ra bên ngoài và trở thành
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: Lưu Văn Thuyết