TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

NGUYỄN THỊ SONG TỨ
BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CÁC CHỦNG AZOTOBACTER Ở HUYỆN ĐƠN DƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đà Lạt, năm 2013
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CÁC CHỦNG AZOTOBACTER Ở HUYỆN ĐƠN DƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD : Th.S NGUYỄN KHOA TRƯỞNG
SVTH : NGUYỄN THỊ SONG TỨ
Đà Lạt, năm 2013
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khóa khóa luận do chính bản thân tôi nghiên cứu dưới sự
hướng dẫn của thầy Nguyễn Khoa Trưởng. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là
trung thực không hề sao chép lại dưới mọi hình thức. Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.
Nguyễn Thị Song Tứ
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt, Ban
chủ nhiệm Khoa Sinh học đã tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian và tài chính cho em theo
học và hoàn thành khóa học này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Th.S Nguyễn Khoa Trưởng đã trực
tiếp hướng dẫn, động viên nhắc nhở và giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận.

2.3.9. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Azotobacter được cố định trên giá thể alginate 19
2.3.10. Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter trên đối tượng cây trồng
19
2.3.10.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu đen 19
2.3.10.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm vi khuẩn Azotobacter lên
khả năng sinh trưởng của rau xà lách 19
2.3.11. Phương pháp xử lí số liệu 20
3.1. Mật độ phân bố của vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất trồng rau ở
Đơn Dương 21
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn Azotobacter
phân lập được 21
3.5. Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm hạt đậu đen từ dịch nuôi cấy
các chủng giống 26
3.6. Kết quả đánh giá độ sống của vi khuẩn Azotobacter trong hạt alginate 28
3.7. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn Azotobacter cố định
trên giá thể alginate lên khả năng sinh trưởng của rau xà lách và mật độ vi khuẩn
trong đất trồng rau xà lách 28
3.7.1. Ảnh hưởng của chế phẩm lên sự tăng trưởng của rau xà lách 28
3.7.2. Ảnh hưởng của chế phẩm đến mật độ vi khuẩn Azotobacter trong đất trồng 29
KẾT LUẬN 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
DANH MỤC BẢNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 2
MỤC LỤC 3
MỞ ĐẦU 1
KẾT LUẬN 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
DANH MỤC HÌNH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT 1

Cho đến nay đã phát hiện ra nhiều chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm
như: vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần cây họ Đậu Rhizobium, vi khuẩn kị khí
Clostridium, vi khuẩn sống tự do trong đất Azotobacter, Beijerinckii. Tuy nhiên, vi
khuẩn Azotobacter hiếu khí sống tự do và phân bố rộng trong đất có khả năng cố định
nitơ cao. Ngoài ra nó còn có khả năng sinh tổng hợp và tiết ra một số chất kích thích
sinh trưởng và phát triển cho cây trồng như: Auxin (IAA), Giberellin, Thymine, acid
nicotinic, acid pantotenic, Biotin, vitamin nhóm B,…
Trong các huyện của tỉnh Lâm Đồng, Đơn Dương là một vùng đất chủ yếu
trồng rau quanh năm. Việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định đạm sẽ góp phần
cải tạo đất, tăng số lượng vi sinh vật có khả năng cố định đạm, nâng cao năng xuất và
chất lượng cây trồng ở địa phương nhằm đem lại hiệu quả kinh tế. Đồng thời cũng góp
phần tích cực vào việc bảo vệ môi trường và cân bằng hệ sinh thái.
Xuất phát từ các nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bước
đầu phân lập và đánh giá hoạt tính các chủng Azotobacter ở huyện Đơn Dương”.
1
Để thực hiện đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu những nội dung sau:
1. Khảo sát mật độ phân bố của vi khuẩn Azotobacter trên một số vùng đất
trồng rau tại khu vực Đơn Dương.
2. Phân lập, đánh giá hoạt tính các chủng vi khuẩn Azotobacter phân lập được.
3. Khảo sát môi trường nhân giống và giá thể cố định vi khuẩn Azotobacter.
4. Bước đầu thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đối tượng cây trồng.
2
1.1. Tầm quan trọng của quá trình cố định nitơ phân tử
Ngày nay cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, con người càng ý thức
được vai trò của nguyên tố nitơ đối với sự sống. Theo khía cạnh tiến hóa thì nitơ là
nhân tố chính tạo nên sinh giới trên trái đất, trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của sinh vật. Giới động vật lấy thức ăn trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật thông qua
các chuỗi dinh dưỡng khác nhau của các loài, còn giới thực vật lại tạo chất sống giàu
nitơ từ nguồn nitơ vô cơ có trong tự nhiên, hoặc sử dụng nguồn nitơ do các nhóm vi
sinh vật tổng hợp [2].

Từ năm 1964 việc nghiên cứu quá trình cố định nitơ luôn được coi là một trong
những vấn đề quan trọng. Cho đến nay, người ta đã xác định được quá trình cố định
nitơ phân tử từ khí quyển chủ yếu được thực hiện bởi đại diện của nhóm vi sinh vật
nguyên thủy Procaryote, trong đó có vi khuẩn Azotobacter [4].
1.2. Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử
Việc cố định nitơ phân tử trong một thời gian dài vẫn là một bí mật đầy hấp dẫn
của tự nhiên.
Trong không khí hàm lượng nitơ chiếm khoảng 78.16% (theo thể tích trong
không khí). Thế nhưng ngoài nhóm vi sinh vật cố định nitơ phân tử thì tuyệt đại đa số
các cơ thể sống không có khả năng này. Nguyên nhân chủ yếu là do phân tử nitơ tồn
tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ ba dây nối rất bền vững
(N≡N). Năng lượng của ba dây nối này vào khoảng 255kcal/M. Vào năm 1905, lần
3
đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ các dây nối này làm cho N
2
liên kết
với các canxi để tạo thành một phân tử nitơ hóa học đầu tiên là canxi xianamit. Muốn
thực hiện phản ứng này người ta phải duy trì ở nhiệt độ cao 1000-1100
0
C. Điều này
làm hạn chế về mặt hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Trong khi đó, tế bào vi sinh
vật phá vỡ mối liên kết này chỉ bằng một phản ứng enzyme đơn giản, ở điều kiện nhiệt
độ, áp suất bình thường.
Nếu khám phá ra được cơ chế của quá trình cố định nitơ nhờ vi sinh vật thì rõ
ràng có thể mở ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ các quy
trình sản xuất phân đạm hóa học thành sản xuất phân đạm vi sinh.
Chu trình tuần hoàn nitơ trong tự nhiên là điều kiện rất quan trọng mà thiếu nó
sự sống trên hành tinh chúng ta không thể có được. Để thực hiện chu trình này cần
phải tồn tại một mối quan hệ phức tạp giữa tất cả các cơ thể sống. Điều quan tâm lớn
nhất hiện nay là sự cố định nitơ phân tử (N

(Mg
2+
…).
N
2
+ AH
2
+ ATP → NH
3
+ A + ADP + Pvc
Tuy nhiên quá trình khử N
2
thành NH
3
được X.N.Vinogratski nêu lên lần đầu
tiên vào năm 1894. Về sau người ta đã dùng những phương pháp hiện đại để nghiên
cứu và hoàn toàn xác nhận giả thuyết này [1].
Về nguồn cung cấp năng lượng ở các nhóm vi sinh vật khác nhau thì khác nhau.
Đối với Azotobacter và một số loài vi sinh vật cố định nitơ khác thì ATP được sinh ra
trong qúa trình hô hấp.
Enzyme nitrogenase được tách ra từ các vi sinh vật cố định nitơ khác nhau (các
loại vi sinh vật, tảo lam, vi khuẩn nốt sần cây họ đậu, vi khuẩn cố định đạm sống tự
do) nhưng cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng tuân theo một quy luật chung.
4
Một phức hệ enzyme nitrogenase được cấu tạo từ hai tiểu phần khác nhau:
Tiểu phần I: Tiểu phần protein – sắt (pro-Mo-Fe). Trọng lượng phân tử khoảng
220.000, chứa 2 nguyên tử Mo, 32 nguyên tử sắt và 25-30 nguyên tử lưu huỳnh. Tiểu
phần I gồm 2 phần dưới đơn vị hợp thành. Trung tâm hoạt động của enzyme
nitrogenase nằm trong tiểu phần I do các nguyên tử Mo tạo nên.
Tiểu phần II: được gọi là tiểu phần protein sắt (viết tắt là pro-Fe) có trọng lượng

sơ đồ sau:[5]
Hydrogenase tham gia hoạt hóa hydro thành ion rồi chuyển ion này đến
feredoxin, đồng thời tham gia bẻ gãy 1 trong 3 cầu nối của phân tử nitơ. Federoxin làm
5
nhiệm vụ chất cho điện tử. Để khử một phần tử protein có trọng lượng phân tử thấp
khoảng 6.000 có chứa Fe không có nhóm hemin hoặc flavin.
Federoxin làm nhiệm vụ chất cho điện tử. Để khử một phân tử nitơ thành NH
3
cần phải sử dụng 6 điện tử. Để vận chuyển 1 điện tử ít nhất cần một phân tử ATP,
trong thực tế 2 phân tử ATP, người ta kết luận rằng có 12 phân tử ATP được sử dụng
trong qúa trình đồng hóa một phân tử nitơ. Phương trình chung của quá trình khử nitơ
như sau:
N
2
+ 6 H
+
+ 6e
-
+ 12 ATP + 12 H
2
O → 2 NH
3
+12 ADP +12 Pi
Trong quá trình cố định nitơ, mỗi loại vi sinh vật khác nhau sử dụng cơ chất
khác nhau: vi khuẩn hiếu khí sống tự do có nguồn cho điện tử và hydro là NAD
+
, năng
lượng lấy trong qúa trình hô hấp, còn vi khuẩn kị khí sống tự do. Nguồn điện tử và
hydro là pyruvate và thiosulphate.
Ngày nay nhiều nhà khoa học đã chứng minh NH

Stăckê (1930) phân lập được trên ruộng lúa có độ acid khá cao. Về sau Decx (1950)
phân lập được chúng từ đất của một vườn thực vật ở Java. Vi khuẩn thuộc giống
Beijerinskii có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình que. Khi còn non kích thước khoảng
0,2- 0,5 × 1,0-4,5µm, có loại di động được, không sinh bào tử. Phần lớn các loài
Beijerinskii sinh trưởng được trên môi trường vô đạm chứa glucose. Khuẩn lạc nhầy,
lồi, không màu, khi về già có màu tối [2].
Vi khuẩn thuộc giống Beijerinskii thường có thể cố định được từ 16 – 20mg
nitơ phân tử khi đồng hóa hết 1gram thức ăn cacbon. Vi khuẩn Beijerinskii có khả
năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide, đồng hóa tinh bột và
acid hữu cơ kém. Khác với Azotobacter,Beijerinskii có tính chống chịu cao với phản
ứng acid. Chúng có thể phát triển tốt ngay ở đất có giá trị pH=3,0. Chúng chịu đựng
được trong môi trường đất có nồng độ Al và Fe cao. Chúng có thể phát triển được cả
trong đất trung tính hay hơi kiềm.
Vi khuẩn Beijerinskii phân bố rộng rãi trong đất ở các nước nhiệt đới. Người ta
còn thấy chúng có mặt trên lá của một số cây ở Indonexia [1].
6
1.3.2. Vi khuẩn kị khí Clostridium
Năm 1893, lần đầu tiên Vinogradxki phát hiện được một loài vi khuẩn kị khí
sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử. Đó là loài Clostridium pasteurianum.
Tế bào của C. pasteurianum có kích thước khoảng 2,5-7,5 × 0,7-1,3µm, có thể
đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn. Khi còn non có tế bào chất
đồng đều, có khả năng di động. Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tế bào mất khả
năng di động. Bào tử thường có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữa hay gần
một đầu của tế bào. Bào tử có kích thước lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dưỡng.do đó
khi mang bào tử tế bào thường có hình con thoi. Kích thước của bào tử khoảng 1,3 ×
1,6 µm.
Clostridium có khả năng đồng hóa các monosaccharide, disaccharide và một số
polysaccharide (như tinh bột, dextrin). Chúng có thể đồng hóa cả nhiều rượu bậc cao
và một số hợp chất chứa cacbon khác nữa. Khi lên men hidrat cacbon, Clostridium
thường làm tích lũy acid hữu cơ, butanol, etanol, acetone CO

bào mới [1, 6].
Trong môi trường có chứa etanol là nguồn cacbon duy nhất, Azotobacter giữ
được trạng thái hình que di động trong thời gian khá dài. Trên môi trường đặc, khuẩn
lạc Azotobacter có dạng nhầy, đàn hồi, khá lồi, có khi có dạng nhăn nheo, khi già có
màu vàng lục, màu hồng hay màu nâu đen.
Azotobacter rất mẫn cảm với pH của môi trường. Nói chung chúng có thể phát
triển được ở pH = 4,5 – 9,0. Tuy nhiên quá trình cố định nitơ chỉ thực hiên trong phạm
vi pH khá hẹp, khoảng 5,5 – 7,2. Nhưng pH thích hợp nhất với chúng là pH = 7,2 –
8,2. Môi trường acid rất bất lợi đối với sự phát triển và hoạt động của Azotobacter.
Ngược lại trong môi trường từ trung tính đến kiềm yếu luôn luôn có nhiều vi khuẩn
Azotobacter trong đất.
7
Azotobacter thuộc loại vi khuẩn có khả năng chịu nồng độ muối khá cao. Người
ta nhận thấy Azotobacter có thể phát triển trong các môi trường chứa 2,5 – 3,0% NaCl
đã phân lập được những nòi Azotobacter ưa mặn. Nhưng nồng dộ NaCl thích hợp nhất
là 3 – 5%. Thậm chí chúng có thể chịu được ngay cả ở nồng độ 9% NaCl.
Tế bào Azotobacter có áp suất thẩm thấu thấp hơn so với tế bào nấm và xạ
khuẩn. Nhu cầu về độ ẩm của Azotobacter tương tự như nhu cầu của cây trồng.
Azotobacter là loài ưa ẩm. Nhiệt độ thích hợp nhất đối với Azotobacter là 25 – 30
0
C,
nhưng chúng cũng có khả năng chống chịu rất tốt đối với nhiệt độ thấp.
Azotobacter có khả năng tích lũy trong dịch nuôi cấy nhiều chất hoạt động sinh
học (vitamin B1,B6, acid nicotinic, biotin,auxin,…) và còn có khả năng tổng hợp các
chất kháng sinh chống nấm thuộc nhóm anixomixin.
Phần lớn các nòi Azotobacter phân lập được từ tự nhiên có khả năng cố đinh
được trên 10mg nitơ/1gram hợp chất cacbon. Một số nòi trong điều kiện thích hợp có
thể đồng hóa được đến 30gram N/1gram hợp chất hữu cơ [2].
Khả năng cố định của Azotobacter không những phụ thuộc vào từng nòi vi
khuẩn mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ nuôi cấy,

8
màu lục phát huỳnh quang, có khả năng khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng
hóa được manitol, ramnose, benzoat natri 5% [1,7].
1.4. Nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter
Hai loại aminoacid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn
Azotobacter là acid glutamic và acid asparaginic. Nguồn dinh dưỡng hidro cacbon cần
cho sự phát triển của vi khuẩn rất đa dạng bao gồm monosaccharide (glucose, fructose,
lactose,…); disaccharide (saccharose, maltose, xenlobiose,…); trisaccharide (rafinose,
meliciitora,…); polysaccharide (tinh bột, dextrin, glycogen, ); glycerin, manit, sorbit
và các hợp chất thơm.
Azotobacter không có khả năng đồng hóa chất mùn. Chúng chỉ có khả năng
phát triển mạnh trong những đất có nhiều chất hữu cơ dễ đồng hóa. Có khả năng đồng
hóa nhiều loại đường khác nhau, nhất là các sản phẩm phân giải cellulose. Đất có bón
phân xanh, phân chuồng, cày vùi rơm rạ, rác có tác dụng tạo điều kiện thuận lợi cho sự
phát triển nhanh chóng của Azotobacter trong đất. Khi trong môi trường có muối amôn
hay nitrat sẽ làm hạn chế sự cố định N
2
của Azotobacter[2].
Sự phát triển và khả năng cố định đạm của Azotobacter chịu ảnh hưởng rất lớn
của sự có mặt các hợp chất photpho trong môi trường.Azotobacter có thể đồng hóa
nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa photpho. Sự mẫn cảm cao của Azotobacter
với hợp chất photpho trong môi trường cho phép người sử dụng chúng như loại vi sinh
vật chỉ thị để định lượng photpho dễ tiêu trong đất, trong phân lợn.
Canxi cũng ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển của Azotobacter. Người ta
cũng đã sử dụng thành công biện pháp dùng Azotobacter làm vi sinh vật chỉ thị để xác
định nhu cầu bón vôi của từng loại đất. Khi thiếu canxi tế bào Azotobacter sẽ tạo thành
nhiều không bào, ảnh hưởng xấu đối với việc tổng hợp ATP và sự tạo thành
polyphosphate.
Magiê (Mg) được Azotobacter cần với số lượng cao hơn sắt (Fe) khoảng 10 lần.
Nhiều ý kiến không giống nhau về nhu cầu của Azotobacter đối với đồng (Cu). Nhiều

mạnh ở ngay trên bề mặt rễ cây mà lại phát triển mạnh ở khu vực xung quanh rễ. Điều
này nói lên vi khuẩn Azotobacter là vi sinh vật vùng rễ, không cộng sinh với rễ.
Nghiên cứu của Fedorov cho biết số lượng vi khuẩn Azotobacter ở vùng rễ cây là rất
nhỏ, nguyên nhân là do hệ vi sinh vật hội sinh ở vùng rễ đã cạnh tranh đẩy vi khuẩn
Azotobacter ra khỏi bề mặt rễ cây, có thể vi khuẩn Pseudomonas đã cạnh tranh với
nhóm vi khuẩn này.
Trong đất Azotobacter chủ yếu tập trung ở lớp đất bề mặt từ 0 – 25cm. Sự phân
bố của chúng giảm dần theo độ sâu của tầng đất. Đất ở độ sâu 75 – 100cm gần như
không có Azotobacter.
Vi khuẩn cố định đạm sống tự do Azotobacter chủ yếu tập trung ở vùng đất có
thực vật phát triển. Nhiều dẫn liệu cho thấy hoạt động cố định đạm của vi khuẩn vùng
quanh rễ mạnh hơn vùng ngoài rễ 3 – 4 lần. Hiện tượng này khiến cho những sản
phẩm cố định nitơ của vi khuẩn Azotobacter trở nên có lợi cho cây trồng.
Những kết luận liên quan đến điều kiện cho vi khuẩn Azotobacter phát triển là
hết sức quan trọng, vì vậy mật độ tế bào có ý nghĩa quyết định đến lượng nitơ do
chúng cố định được. Kết quả nghiên cứu của Jensen và Kraxinhikov cho biết khi đất
chứa 1.000 tế bào Azotobacter/1g đất thì số lượng nitơ cố định được không quá 2 – 5
kg/ha. Sự có mặt của vi khuẩn Azotobacter trong đất trồng không chỉ làm tăng hàm
lượng nitơ trong đất mà còn có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng nhờ những chất có hoạt tính sinh học do chúng tiết ra. Bằng thực nghiệm
Misuxtin đã chứng minh được rằng vi khuẩn Azotobacter chroococum có khả năng tiết
ra những chất kích thích thuộc nhóm auxin và những chất tương tự giberellin. Ngoài ra
ông còn phát hiện thấy chúng cũng sinh ra một số loại vitamin cần thiết cho sự trao đổi
chất của thực vật như vitamin B6, vitamin PP,…[2]
1.6. Ứng dụng vi khuẩn Azotobacter trong nông nghiệp
Đối với sản xuất nông nghiệp, vi sinh vật có vai trò rất to lớn tham gia tích cực
vào sự phân giải các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các chất khoáng, cố định nitơ phân
tử để làm giàu nitơ cho đất.
Trong hoạt động sống vi sinh vật còn sản sinh ra rất nhiều chất hoạt động sinh
học có tác dụng trực tiếp đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Các

Alginate có trong tất cả các loại tảo nâu (Phaeophyceae) là thành phần của vách
tế bào. Nguồn thu nhận chính alginate trong công nghiệp là tảo bẹ lớn. Alginate
thường được chiết trong kiềm, sau đó được kết tủa bằng acid hay muối canxi [8].
Alginate là muối của acid Alginic một polymer của β-1,4-D-Mannuroic acid
(M) và α-1,4-L-Guluronic acid (G). Acid Alginic là một polymer ái nước và có tính
keo, được tinh chế từ nhiều loại rong nâu khác nhau. Công thức cấu tạo của acid
Alginic: (C
6
H
6
O
6
)n.
Alginate là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000-
200.000 do D-Mannuroic acid và L-Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết
glucozit. Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu. Được dùng làm
chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhũ hóa, không tan trong nước và dung
môi hữu cơ, tan chậm trongdung dịch Carbonate natri, Hydroxide natri.
Các dạng thương phẩm của Alginate: Natri Alginate, Kali Alginate, Amon
Alginate, Mg Alginate, Canxi Alginate, Propylen glycol Alginate.
Các dạng này được chiết xuất từ quá trình trích ly từ nhiều loại rong nâu khác
nhau bao gồm Macrocytis Pyrifera, Laminaria, Digitata và Ascophylum nodosum
Sodium Alginate là muối của acid Alginic có liên kết (1-4) guluronic acid. Alginate
polymer ưa nước và có thể tạo thành thể gel không thuận nghịch với sự hiện diện của
Ca
2+
. Bằng cách này Alginate được đánh giá có khả năng tạo màng tốt. Khi hòa tan các
Alginate vào nước và sẽ ngậm nước và tạo dung dịch nhớt, độ nhớt tỉ lệ thuận với
chiều daì của phân tử Alginate. Alginate cũng có khả năng tạo màng rất tốt. Các màng
rất đàn hồi, bền, chịu dầu và không dính bệt. Màng thuộc nhóm polysacharide có khả

chịu nhiệt. Tại Hoa Kì người ta đã sử dụng alginate như các chất ổn định trong công
nghệ lạnh, tạo cho vải bóng mịn, là tác nhân đồng hóa sữa. Alginate có khả năng hấp
thụ được các kim loại nặng được ứng dụng trong công nghệ làm sạch nước [9].
Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong alginate canxi bằng
phương pháp bẫy đã trở thành một kĩ thuật ứng dụng rộng rãi. Phạm vi sử dụng của nó
ngày càng rộng, từ các vi khuẩn cho tới tế bào của động vật có vú. Việc ứng dụng của
nó rất đa dạng, kỹ thuật chuẩn bị lại khá đơn giản. Quy trình chung là trộn lẫn dung
dịch alginate canxi và dịch huyền phù tế bào. Dịch huyền phù thu được sẽ được cho
nhỏ giọt vào dung dịch tạo gel như CaCl
2
. Các hạt gel alginate canxi hình thành có
dạng hình cầu.Trong mỗi hạt gel tạo thành một mạng lưới (matrix) bao quanh các tế
bào. Cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán
cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel [11].
1.8. Vị trí địa lý và thổ nhưỡng của Đơn Dương
1.8.1. Vị trí địa lý
Đơn Dương là huyện nằm ở phía Đông Nam Đà Lạt, phía Nam cao nguyên
Lâm viên. Phía Đông giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây và phía Nam giáp huyện Đức
Trọng, phía Bắc giáp thành phố Đà Lạt và huyện Lạc Dương [13].
12
1.8.2. Địa hình
Đơn Dương có độ cao trên 1000 m. Với diện tích đất tự nhiên trên 61.000 ha ;
trong đó đất sản xuất nông nghiệp gần 17.000 ha, đất lâm nghiệp 38.000 ha.
Địa hình huyện Đơn Dương có thể chia thành 3 dạng chính:
- Địa hình núi cao bao gồm khối núi chạy dài theo hướng Đông Bắc - Tây Nam
có độ cao phổ biến 1.000-1.500m , độ dốc trên 15
0
, đại bộ phận diện tích còn rừng
thông che phủ.Đơn Dương có các đỉnh núi cao như: Yang Kuet (1.431m) ở phía Đông
Bắc Đơn Dương; Kanan (1.485m), Ya Bonnonh (1.650m), Srêla (1.486m), Parglo

Tổng diện tích đất tự nhiên: 61.032 ha [10].
13
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vi khuẩn Azotobacter
Các chủng vi khuẩn Azotobacter sử dụng trong các thí nghiệm được phân lập từ
đất trồng rau tại khu vực Thôn Sao Mai – Ka Đơn - Đơn Dương – Lâm Đồng.
2.1.2. Cây đậu đen
Tên khoa học: Vigna cylindrica
Họ đậu: Fabaceae
Tên tiếng việt: đậu đen, hắc đại đậu, hương xị.
Đậu đen là loài cây thuộc họ Đậu mọc quanh năm, toàn thân không lông. Lá
kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai bên. Hoa màu tím
nhạt. Quả giáp dài, tròn, bên trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen.
2.1.3. Cây rau xà lách
Tên khoa học: Lactuca sativa
Họ cúc: Asteraceae
Tên tiếng việt: Xà lách, rau sống
Tên tiếng anh: Salad
Xà lách là loại rau rất giàu Vitamin A và các loại khoáng chất như Ca,Fe. Ở
Việt Nam, xà lách được dùng để ăn sống. Tính chất của xà lách là giải nhiệt, lọc máu,
khai vị, cung cấp khoáng chất, giảm đau, gây ngủ, trị ho, trị tiểu đường.
Ở nước ta sử dụng hai nhóm xà lách chủ yếu sau:
- Xà lách trứng: Lá trắng, chịu được mưa nắng, cuộn chắc
- Xà lách li ti: á xanh nhạt, tán lớn, ít cuộn, xốp, chịu úng.
2.2. Vật liệu và môi trường nuôi cấy
2.2.1. Môi trường thạch Ashby
KH
2
PO
4

PO
4
0.2 g
K
2
SO
4
0.1 g
CaCO
3
5.0 g
MgSO
4
.7H
2
O 0.2 g
NaCl 0.2 g
Glucose 20 g
Agar 20 g
H
2
O 1000 ml
Nước chiết giá đỗ 200g
pH 7.0
Môi trường được khử trùng ở 121
0
C/30 phút.
2.2.4. Môi trường lỏng nước chiết giá đỗ
Thành phần tương tự môi trường thạch nước chiết giá đỗ không bổ sung agar
2.2.5. Thuốc nhuộm Gram

loãng ở các nồng độ 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
cấy vào đĩa Petri chứa sẵn môi trường thạch
ashby, mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa.
- Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30
0
C, 72 giờ.
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền
- Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng, thuần khiết, mọc riêng biệt, dùng que cấy đã vô
trùng cấy ria qua môi trường thạch đĩa.
- Đem ủ ở nhiệt độ 30
0
C. Khi vi khuẩn mọc đều ta tiến hành cấy chuyền sang
môi trường mới 1 hoặc 2 lần để thu nhận giống thuần chủng.
- Cấy chuyền qua các ống thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ 30
0
C. Sau 3 ngày khi vi
khuẩn phát triển mạnh đem bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ 4 – 6
0
C. Sau 2 - 3 tháng
tiến hành cấy chuyền lại một lần.
2.3.3. Phương pháp nhân giống
Dùng que cấy vô trùng cấy giống từ các đĩa giống thuần chủng vào 100ml môi
trường dịch thể. Tiến hành nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt: 120 vòng/phút, nhiệt độ