i

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
LỜI MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN 3
1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin 3
1.1.2. Ứng dụng của chitin – chitosan 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM 6
1.2.1. Tỷ lệ thu hồi phế liệu tôm 6
1.2.2. Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm 7
1.2.3.Thành phần sinh hoá của vỏ tôm 8
1.3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN 9
1.3.1. Giới thiệu công nghệ sản xuất chitin 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam 11
1.3.2.1. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học
12
1.3.2.2. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến
15
1.3.2.3. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme
21
1.4. Tổng quan về enzyme protease 23
1.4.1. Phân loại protease 23
1.4.2 Nguồn thu nhận enzyme protease 24
1.4.3. Một số loại protese thường dùng 25
PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26
2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm 26
2.1.2. Enzyme Protease 26

enzyme Pepsin 40
3.4.Kết quả nghiên cứu tối ưu công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin và HCl 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾn 51
Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu: 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC 54
iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo của Chitin 4
Hình 1.2. Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á 12
Hình 1.3. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman……………
Hình 1.4. Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) 14
Hình 1.5. Quy trình sản xuất của Pháp 15
Hình 1.6. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản 16
Hình 1.7. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa
học Việt Nam 17
Hình 1.8. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với
một công đoạn xử lý kiềm 18
Hình 1.9. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản. 20
Hình 1.10. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006). 21
Hình 1.11. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan 22
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt lên nguyên liệu
trước thủy phân 28
Hình 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu trước thủy phân 34
Hình 3.2.a. Mô hình biểu diễn phân phối chuẩn 48
Hình 3.2.b. Mô hình biểu diễn phân phối chuẩn……… 49
Hình 3.3. Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt và thời gian tới hiệu quả khử protein 55
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mức độ ảnh hưởng của các yếu tố 42
1

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng
nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu,
tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh từ giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế
biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá
lớn khoảng 70.000 tấn/năm. [1]

Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất
chitin, chitosan, glucosamine và các sản phẩm khác. Do vậy việc nghiên cứu và
phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất cần thiết nhằm nâng cao giá trị sử
dụng phế liệu này và làm sạch môi trường.
Theo điều tra ban đầu thì công nghệ sản xuất chitin – chitosan trong nước
hiện nay chủ yếu theo phương pháp hóa học với việc sử dụng hóa chất có nồng độ
cao, thời gian xử lý dài, không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn
gây ô nhiễm môi trường, khó khăn cho quá trình xử lý nước thải, đồng thời tốn chi
phí cao Vì vậy, là xu thế mới hiện nay ứng dụng công nghệ sinh học trong sản
xuất chitin, thay thế hóa chất bằng enzyme để giảm tối đa lượng hoá chất sử dụng,
giảm ô nhiễm môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm.
Ở Việt Nam trong những năm qua đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu sử dụng
enzyme protease vào công đoạn khử protein của quy trình sản xuất chitin-chitosan.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng đơn lẻ một loại enzyme
protease thì hiệu quả khử protein không cao, lượng enzyme sử dụng nhiều và vẫn
phải dùng kết hợp với hóa chất. Nếu kết hợp hai enzyme protease để khử protein có
thể sẽ mang lại tác dụng tích cực hơn.
Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Chế biến-3

PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN
1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin
a. Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên
Chitin là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng
thứ hai sau xellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật.
Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một
số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn.
Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da
nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở
thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo [2]
.

Chitin là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc
của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl- β-D-glucosamine) liên kết với
nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức. Hơn
nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu
nối dặng trị (coralente) với các protein, CaCO
3
và các hợp chất hữu cơ khác.[3]
Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin
chiếm khá cao dao động từ 14 – 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy, tôm, cua, ghẹ
là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan.[3]
b. Cấu trúc của chitin

hexafluoro –isopropul alcohol (CF
3
CHOHCF
3
) và hexafluoracetone sesquihydrate
(CF
3
COCF
3
.H2O)[15]. Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO
4
, nước javen,
NaClO,…người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin [3].
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884÷890 µm.
Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,
có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin bị enzyme lysozyme, một
loại enzyme chỉ có ở cơ thể người, phân giải thành mono N-acetyl-D-glucosamine.
Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc (40-50%), ở nhiệt độ cao thì
chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan.
Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành
Glucosamine và acid acetic.
1.1.2. Ứng dụng của chitin – chitosan
a. Trong y học, mỹ phẩm[3][6]
Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm:
5

Tá dược độn, tá dược chính, viên nang mềm, nang cứng…làm chất mang
sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng kéo dài, làm hoạt chất chính
để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc
bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu

lửa. Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động.
Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na
2
SO
4
bão hòa rồi đem kéo
sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai. Đem sợi này trộn với sợi
cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose. Khả năng bắt màu thuốc nhuộm
càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin.
• Trong công nghiệp giấy
Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng
bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bền của giấy khi ẩm ướt,
tăng độ nét khi in. Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy.
• Trong ngành phim ảnh
Phim chitosan có độ nhớt rất cao, không tan trong nước, acid. Độ cứng được
cải thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý phim bằng dung dịch acid.
• Ứng dụng trong mỹ phẩm
Chitosan được sử dụng trong sản xuất kem chống khô da, do bản chất
chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhóm NH4
+
thường được các
nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím. Vì vậy
chitosan là gạch nối giữa hoạt chất của kem và da.
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM
1.2.1. Tỷ lệ thu hồi phế liệu tôm
Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn
chính là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng. Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh
trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuôi tôm
đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm
2003, năm 2012 diện tích nuôi tôm của nước ta xấp xỉ khoảng 640.000 ha.

Vỏ chia làm 4 lớp chính đó là lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi và lớp không bị
canxi hóa.
8

- Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp
màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì không.
- Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện của những thể hình hạt của
vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khí hoặc những
không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,
là con đường cho caxi thẩm thấu vào.
- Lớp biểu bì: những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ
bởi Fucxin, có điểm pH = 5.1 không chứa chitin. Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt
màu xanh với anilin xanh. Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của acid ở
nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt.
- Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải
đều khắp.
- Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một
phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền
vững không có canxi và puinone.
1.2.3. Thành phần sinh hoá của vỏ tôm
Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng
Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt
lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm. Nếu
công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu
nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn.
Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với
chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo
proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các
protein dưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các

acetone hoặc hydrogen peroxide. Bước này là không bắt buộc và phụ thuộc vào yêu
cầu của sản phẩm cuối cùng. Dựa vào đặc điểm của tác nhân được sử dụng để khử
khoáng và protein, công nghệ sản xuất chitin được chia thành hai phương pháp
chính để sản xuất chitin: phương pháp hóa học và phương pháp sinh học.
Phương pháp hóa học:
10

- Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc sử dụng HCl hoặc acid
hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế như sau:
CaCO
3
+ 2HCl = CaCl
2
+ CO
2
+ H
2
O
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 6HCl = 3CaCl
2
+ 2H
3
PO
4

11

pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, các
phương pháp sản xuất chitin hiện có đang thải ra một lượng chất thải lớn và khó xử
lý gây ô nhiễm môi trường, việc sử dụng quá nhiều hóa chất làm ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp thu gom và xử
lý trước khi thải ra môi trường[17]. Ngược lại, trong phương pháp sinh học,
enzyme được sử dụng thay hóa chất sẽ làm tăng chất lượng sản phẩm, protein sau
quá trình thủy phân có thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc,
gia cầm Cho nên sẽ tiết kiệm được chi phí cho việc xử lý nước thải nguồn.
Tóm lại, muốn sản phẩm chitin có chất lượng tốt thì chúng ta phải áp dụng
phương pháp xử lý phù hợp như việc sử dụng enzyme.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của
Chitin - Chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước
đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung
Quốc, Ấn Độ, Pháp.
Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ
12 1.3.2.1. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học
a. Quy trình của Steven

b. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman

Chitin d
ạ
ng b
ộ
t màu kem

NaOH 1M
t
o
= 100
o
C
t= 42h
w/v =
NaOH 1M
To = 100
o
C
T= 12h
w/v =
HCl 2M
t
o
phòng
t = 5h

w/v=
HCl 2M
t

NaOH 15M
t
o
= 150
o
C
t = 1h
Sấy khô
Chitosan
V
ỏ
cua khô

15

1.3.2.2. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến
a. Quy trình sản xuất của Pháp


phòng
t = 6 phút
w/v = 1/10

Rửa trung tính
Deacetyl chitin
NaOH 40%
t
o
= 85
o
C
t =
4h

w/v = 1/4
Rửa trung tính
Chitosan
Vỏ tôm
Hấp chín, phơi khô
Xay nhỏ
Tách protein
Rửa trung tính
Ngâm HCl
Ngâm aceton
To phòng
T = 30 phút
w/v = 1/5
Ngâm NaOCl
16

o
phòng
t = 48h
w/v = 1/2,5
NaOH 8%
t
o
= 100oC
t = 2h
w/v = 1/2,5
T
ẩ
y màu

Chitin

N
ấ
u trong NaOH

R
ử
a trung tính

Chitosan

NaOH 40%
t
o
= 80

o
= 90÷95
o
C
t = 3h

HCl 4%
t
o
phòng
t = 24h

NaOH 3%
t
o
= 90÷95
o
C
t = 3h

NaOH 40%
t
o
= 90÷95
o
C
t = 3h

Rửa trung tính
Nấu trong NaOH

Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein, lipid
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h
w/v = 1/10
HCl 10%
t
o
phòng
t= 5h

w/v = 1/5
NaOH 40%
t
o
= 80±2
o
C
t = 5h
w/v = 1/10
Rửa trung tính
Chitosan
19

dụng. Theo quy trình công nghệ này sản phẩm chitosan đạt được có các chỉ tiêu
chất lượng như bảng 1.1

HCL 7%
v/w=5/1
T
o

phòng

T=24h
NaOH 6%
v/w=5/1
T
o
phòng
T=24h
Rửa trung tính
NaOH 40%
v/w10/1
T
o
=80
o
C
T=6,5h
Deacetyl hóa
Ngâm rửa trung tính
Phơi, sấy
Chitosan
21

1.3.2.3. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme

C

tỷ
lệ E/NL 3%
w/v = 1/1

Sấy lạnh
Khử khoáng HCl 2,5%, 2h, t
o

phòng

Rửa trung tính
Sấy khô (60
o
C, 16h)
Chitin
Bột protein