Luận văn
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình
sản xuất Chitin theo phương
pháp sinh học kết hợp hóa học
i
LỜI CẢM ƠN
Qua 2 tháng nỗ lực phấn cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các
thầy cô và bạn bè em đã hoàn tất đề tài này. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc đến Tiến sĩ: Nguyễn Duy Nhứt và cô giáo: Phan Thị Thương
người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình thự tập và trực
tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề
tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô trong khoa
công nghệ hoá phân tích đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức
trong những năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô
phụ trách phòng thí nghiệm hoá phân tích, cùng thầy cô bộ môn công nghệ
hoá, bộ môn hoá phân tích và công nghệ thực phẩm, các anh chị và cô chú
ở Viện nghiên cứư và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận
lợi trong suốt thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp CĐH 29, cùng các bạn sinh
viên thực tập tại phòng thí nghiệm ở Viện đã nhiệt tình giúp đỡ động viên
em.
Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến
cùng anh chị em thân yêu. Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn
tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Sinh viên
Trần Thị Mỹ Châu
ii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
a.Khử lần 1: Dùng acid benzoic 39

nhất 48
Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH 49
iv
Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng
NaOH 50
Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc
nhất 50
Bảng 20. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử
lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu 52
Bảng 21. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ
khử khoáng bằng C6H5COOH 53
Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng
C6H5COOH 53
Bảng 23. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử
protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối
ưu 55
Bảng 24. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ
khử khoáng bằng HCl 55
Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl55
Bảng 26. Kết quả đo OD330nm 1
Bảng 27. Kết quả đo OD570nm 1
Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm 2
Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án 3
Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng
enzyme Alcalase 3
Bảng 31.Các số liệu dùng để tính toán 4
Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein
bằng enzyme 6
Bảng 33.Các thông số tối ưu 6
Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm 7

Hình 7.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản 20
Hình 8. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện
khoa học Việt Nam 21
Hình 9. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học
với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003) 22
Hình 10. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản 24
Hình 11. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) 25
Hình 12. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan 26
Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất 32
Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin không dùng acid benzoic.(đối chứng) 33
Hình 15.Công thức của phức Biuret 42
Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret 45
Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret 46
Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo
phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson 49
Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp
đường “lên dốc” của BoxWillson 51
Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm C6H5COOH theo
phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson 54
Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm HCl theo phương pháp
đường “lên dốc” của BoxWillson 57
Hình 22.Thiết bị ổn nhiệt Memmert 19
Hình 23. Thiết bị đo Uvmini-1240 19
Hình 24.Máy li tâm 20
vii
Hình 25.Thiết bị Vortex 20
Hình 26.Sự bắt màu của dung dịch BSA sau khi cho thuốc thử Biuret 20
Hình 27. Công thức cấu tạo của Sodium citrate 20
Hình 28. Mono Sodium Citrate Anhydrous 21
Hình 29. Dung dịch protein và thuốc thử Biuret 21

có một hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn. Nguyên nhân chủ yếu là do hàm
lượng chất lơ lửng, trong đó chủ yếu là các chất có nguồn gốc từ protein. Chúng có
tính chất là rất khó lắng trong quá trình xử lí. Như vậy, nếu chúng ta có thể thu hồi
protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase thì sẽ tận dụng được nguồn
chất dinh dưỡng trong phế liệu đầu vỏ tôm để làm bột dinh dưỡng cho người, thức
ăn cho gia súc, gia cầm, từ đó nâng cao nâng cao được giá trị của nguyên liệu, giảm
tải cho quá trình xử lí nước thải, hạn chế sự ô nhiễm môi trường. Đồng thời việc sử
dụng thủy phân bằng enzyme sẽ hạn chế việc sử dụng hóa chất, gây ô nhiễm môi
trường. Trong thực tế hiện nay tại các cơ sở sản xuất phải thu nhân nguyên liệu từ
các khu vực xa, không tập trung và khối lượng không lớn gây khó khăn về chi phí
vận chuyển. Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chế độ thủy phân bằng enzyme góp
1
phần kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu, giảm chi phí do phơi hoặc sấy khô
nguyên liệu, giảm sự ô nhiễm môi trường do không vận chuyển tạm thời, đồng thời
loại bỏ một phần các chất khoáng, protein.
Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Chế biến-
Khoa Chế biến-Trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cô Thạc sĩ Ngô
Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản
xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học.”
2.Mục đích của đề tài:
Xác định các điều kiện tối ưu để khử protein từ phế liệu tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase và NaOH, đồng thời xác định các điều
kiện tối ưu để khử khoáng bằng acid benzoic kết hợp HCl nhằm giảm thiểu hóa chất
sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao chất lượng Chitin.
3. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:
Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất chitin với mục
đích tận dụng nguồn protein từ đầu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất nhằm giảm ô
nhiễm môi trường và sản xuất ra chitin-chitosan có chất lượng cao và ứng dụng vào
các lĩnh vực đặc biệt như ứng dụng trong y học, mỹ phẩm…. Đề tài cũng là nguồn
tài liệu hữu ích phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này.

mối chúa. Sự deacetyl bằng kiềm, Chitin tạo thành Chitosan và tan được trong dung
dịch acid acetic loãng.
1.1.2. Cấu trúc và tính chất của Chitin-Chitosan
1.1.2.1 Cấu trúc của Chitin-chitosan
Chitin-Chitosan là một polysaccharide nên có cấu trúc dạng chuỗi.
Trong đó : Chitin : R : -NH-COCH
3
Chitosan : R : -NH
2
3
CHITIN: Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến
tính gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside.
Công thức phân tử: (C
8
H
13
O
5
N)
n
Phân tử lượng : M = (203,19)
n
Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:
Đối với tôm hùm : n = 700÷800
Đối với cua : n = 500÷600
Đối với tôm thẻ: n = 400÷500
Công thức cấu tạo:

Hình 1.Cấu tạo của Chitin.
CHITOSAN: Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, gồm các phân tử D-

Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac
(NH
3
), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia. Điều này có thể là do
sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị trí C
2
bằng nhóm acetamic (NHCOCH
3
) đã
ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết.
Khi nung nóng Chitin trong dung dịch NaOH đặc thì Chitin sẽ bị khử mất
gốc acetyl tạo thành Chitosan. Khi đun nóng Chitin trong acid HCl đặc thì Chitin sẽ
bị thủy phân tạo thành Glucosamine 85,5%, acid acetic 14,5%.
5
CHITOSAN:
Đặc tính cơ bản của Chitosan: Chitisan có nguồn gốc thiên nhiên, không độc,
dùng an toàn cho người trong thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, có tính hòa hợp sinh
học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có nhiều tác dụng sinh học đa
dạng: có khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại
khác nhau, kích thích tăng sinh tế bào ở người, động vật, thực vật, có khả năng nuôi
dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.
Tính chất hóa học : Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không
mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong dung dịch acid loãng. Loại Chitosan có khối
lượng trung bình thấp từ 100000÷400000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và
trong thực phẩm.
Tính chất sinh học: Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như : tính
kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát
triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo
dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u.
Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to

chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh.
Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống
bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.
1.1.3.4. Ứng dụng trong sinh học
Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh
vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp
polymer sinh học.
1.1.3.5. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác.
Trong công nghiệp dệt:
Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm có thể thay thế
được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ xát, bề mặt
đẹp, bền trong kiềm.
7
Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan chitosan trong dung dịch acid
acetic loãng cùng với axetat nhôm và axit stearic thu được hỗn hợp. Hỗn hợp này
đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt
lửa. Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động.
Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na
2
SO
4
bão hòa rồi đem kéo
sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai. Đem sợi này trộn với sợi
cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose. Khả năng bắt màu thuốc nhuộm
càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin.
Trong công nghiệp giấy:
Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng bằng 1%
trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bền của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét
khi in. Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy.
Trong ngành phim ảnh:

khoảng 390.000 tấn năm 2010. Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến
Thủy sản, Đại học Thuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính
khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm. Trần Thị
Luyến (2004) cho biết trong vỏ tôm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng,
trong vỏ tôm khô khoảng 20-40% khối lượng. Như vậy hàng năm có thể sản xuất
gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả
kinh tế cho ngành Thuỷ sản .
Phế liệu tôm (PLT) là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm
bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy
cách hoặc tôm bị biến màu. Tuỳ thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế
liệu có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm. Có thể lấy tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm.
Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm. Với sản phẩm
tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng
lượng tôm. Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%,
như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%. Lượng phế liệu này có thể
giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế
biến tốt hơn. Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng
9
chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho
ngành thuỷ sản.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-70%
(Watkin và cộng sự, 1982 ; Evers và Carroll [19], trung bình khoảng 50% so với
khối lượng tôm chưa chế biến. Halanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tôm có
thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [20]. Phần lớn tôm được đưa vào chế biến
dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ,
đuôi và chân chiếm 10-15% trọng lượng của tôm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỉ lệ này
tuỳ thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng [5] [6].
Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm[5]
Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này

Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với
chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…
như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các
protein dưới dạng phức hợp chitin-protein; liên kết với các hợp chất khoáng và các
hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.
Canxi: Trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ
yếu là muối CaCO
3
, hàm lượng Ca
3
(PO
4
)
2
mặc dù không nhiều nhưng trong quá
trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO
4
không tan trong HCl gây khó
khăn cho quá trình khử khoáng.
Sắc tố: Trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là
Astaxanthin.
Enzyme: Theo tạp chí Thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của
đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi. Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội
tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu.
Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần
khác như: nước, lipid, phospho,…
1.2.2. Công nghệ sản xuất Chitin-Chitosan
11
Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy

+ H
2
O
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 6HCl = 3CaCl
2
+ 2H
3
PO
4
Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:
12
a. Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến
sản phẩm còn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm
chất lượng sản phẩm.
b. Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá
lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí.
c. Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị
nát sẽ rất khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm
sau này. Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị
loại triệt để.
Thông thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu có
điều kiện ta có thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn.
-Phương pháp sinh học: Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại công đoạn

Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm
pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN-CHITOSAN TRÊN THẾ
GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của
Chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành
công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn
Độ, Pháp.
Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ như:[5]
1.3.1. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học
- Quy trình của Stevens
14
Hình 3.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á
Cao hơn 1%
Cao hơn 1%
Phế liệu tôm tươi
Khử protein
(NaOH 4%, t = 24 giờ,
t
o
=30
o
C)
Kiểm tra hàm lượng protein
Khử khoáng
(HCl 4%, t=24 giờ, t
o
=30
o

o
C
t= 42h
w/v = 1/2,5
NaOH 1M
To = 100
o
C
T= 12h
w/v = 1/2,5
HCl 2M
t
o
phòng
t = 5h
w/v= 1/10
16
Hình 4.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman
Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65
giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất
đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất.
- Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản):
Hình 5.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)
Nhận xét: Quy trình đã đơn giản hóa công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian
sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan
thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt
thấp do nhiệt độ xử lý ở các công đoạn khá cao.
1.3.2. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến:
Vỏ cua khô
Khử chất vô cơ