TRƯỜNG
TRƯỜNG
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
KHOA CÔNG NGHỆ
KHOA CÔNG NGHỆ
SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

“Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng
trong kiểm tra động vật chuyển gen
Thái Nguyên, 2014
Thái Nguyên, 2014
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
•
Đặt vấn đề
•
Nội dung
•
Kết luận
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
Đặt vấn đề
Đặt vấn đề
•
Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi
bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó.
Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen
chuyển.
•

ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại
(reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những
mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám
phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic
được phát triển.
- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau
của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch
đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.Khái
1.Khái
niệm về lai phân tử
niệm về lai phân tử
=> Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và
được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng
lai DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối
chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác
nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.Khái
1.Khái
niệm về lai phân tử
niệm về lai phân tử
*Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA.
Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ
nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên
kết Hydro nối liền mạch. Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản
ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp,

mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng
càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính
theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base
Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đ
ối với những đoạn DNA ngắn.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH

1.1.3Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch
)
+ Bắt cặp sai lệch ngoài quy tắc ( A=T, G=C) => Giảm tính ổn
định của phân tử lai.
+ Tm giảm 10ºC => 1% bắt cặp sai lệch.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng
* Ảnh hưởng của nồng độ muối:
+ Sự giảm lực ion sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy.
+ Dung dịch càng loãng càng làm mất tính ổn định của chuỗi
xoắn kép DNA.
* Ngoài ra còn các yếu tố như : nhiệt độ tốc độ phản ứng lai phụ
thuộc vào nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai đạt cực đại ở
nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó 25%.

Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2. Phân loại
- Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S
1
, sắc kí

Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất
đậm. Đó là hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thụ tia UV
mạnh hơn DNA mạch đôi.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1
-
Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn
bất kể là DNA hy RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.
-
Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần đem xử lý với
nuclease S1.
-
Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các NA còn lại tương ứng với
các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem
định lượng.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.3 Phương pháp sắc ký trên hydroxylapatite
•
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci.
•
Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc
kháng thể ) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong
các tế bào mà không cần tách chiết.
•
Sau khi bị đốt nóng chúng được làm lạnh để những mạch đơn
va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60
0


•
Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
•
Điện di sản phẩm cắt trên gel
•
Làm biến tính DNA
•
Chuyển DNA lên màng lai
•
Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu
•
Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.1 Phương pháp Southern blot
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi
nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò
được gắn với enzyme thì đem ủ với cơ chất không màu.
Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm không
màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát
hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH