TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

ĐỀ TÀI:
THU NHẬN ENZYME PECTINASE
TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Thực hiện:
1. Trương Thu Hồng Nhung 072523S
2. Văn Thị Quế Phương 072529S
3. Nguyễn Thị Thiết 072588S
4. Nguyễn Thị Thanh Trúc 072628S
5. Nguyễn Thị Yến 072667S
TP. HỒ CHÍ MINH – 6/2009
Trang 1
MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN…………………………………………2
I.1. Nguyên liệu………………………………………2
I.2. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger……… 2
I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase………………….3
 Khái niệm……………………………………… 3
 Phân loại………………………………………….3
 Đặc điểm………………………………………….3
 Cơ chế tác động………………………………… 4
II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM
MỐC ASPERGILLUS NIGER ……………………………… 6
II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase……………….6
II.2. Sơ đồ quy trình……………………………… 11
II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme
pectinase từ nấm mốc Aspergillus niger…………………….14

màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp. Đôi khi chúng
sinh ra các giọt lỏng màu vàng sáng trên bề mặt khuẩn lạc. chúng có hai bộ
cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu, hơi đen và có gai. Túi và sợi
cuống thường có màu nâu bóng. Nhóm này không tạo mycotoxin, nhưng
một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh.
I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase
 Khái niệm : Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ
các polyme pectin. Dưới tác dụng của enzyme pectinase, pectin bị phân huỷ
tạo thành các sản phẩm như: acid galacturonic, galactose, arabinose,
metanol…
 Phân loại:
- Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu
của enzyme. Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành
hai nhóm chính: hydrolase và transeliminase. Cả hai nhóm này đều có đặc
điểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượng
phân tử của các sản phẩm tạo thành.
- Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau:
pectinesterase (PE ), Polymethylgalacturonic ( PMG), polygalacturonase
(PG ), Pectate lyase ( PEL). Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi
là poly - α - 1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụng
trên pectin và trên pectinic acid. Polygalacturonate- transelimiase ( còn gọi
là poly - α - 1,4 D- galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trên
pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách các
đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo – enzyme.
 Đặc điểm: Enzyme thuỷ phân pectinase là sản phẩm trong quá
trình sống của nấm mốc Aspergillus niger và một số nấm mốc khác. Người
ta cấy các chủng nấm mốc này vào trong các môi trường khác nhau, sau đó
Trang 4
đem sấy khô, nghiền thành các sản phẩm khô. Từ qúa trình sống của chủng
nấm mốc này, người ta không những chỉ thu nhận được enzyme thuỷ phân

C. Từ 55- 62
0
C thì vô
hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của PE từ thực vật thượng đẳng cao hơn:
từ 55 – 60
0
C
Các ion kim loại đặc biệt là Na
+
và Ca
2+
và các muối clorua của chúng
sẽ hoạt hoá PE từ nấm mốc Asp.niger. Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4
( thuỷ phân nitrat, FeCl
2
, Al
2
(SO
4
)
3
) sẽ kìm hãm tác dụng của PE.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể có liên
quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức
chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE. Sự liên kết
của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trường hợp này có
khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy
nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion
kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết
ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra.

IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối
mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó không có nhóm
methyl.
Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơ chất phải
có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt.
 Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P. Abershim lần đầu tiên đưa ra
thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đường thuỷ phân.
Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Enzyme này xúc tác
phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làm mất hoạt tính nguyên tử
hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4 và C5.
Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thành hai nhóm:
 Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử polygalacturonic
ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic.
 Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch vòng của
acid digalacturonic.
Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào
II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC
ASPERGILLUS NIGER
Trang 7
II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase
Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong
chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzyme
pectinesterase (PE ).
- Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tại
dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật
nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại
ở nồng độ thấp, như Ca
2+
chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ
hoạt động của enzyme. Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất
khác nhau, trong đó acid pectinic acid là thành phần chủ yếu. các pectin tự
nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide
và protein để tạo thành các protopectin không tan. Có thể phân huỷ để cho
Trang 9
pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì
thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân huỷ phân tử pectin
không tan và chúng không đồng dạng với nhau.
Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl
“MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH
3
có trong
phân tử pectin và chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân
tử acid galactoronic trong phân tử pectin.
Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia
pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl
hóa thấp.
Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50 %
hay MI > 7%. Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm. Muốn tạo
đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %.
Trang 10
Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 %
hay MI < 7%. Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử
pectin. Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có
đường. Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm.
Trong quá trình bảo quản có thể bị tách nước hoặc lão hóa. Quá trình
tạo đông phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nguồn pectin, mức độ methoxy hóa
càng cao thì khả năng tạo đông càng cao. Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin
vào nước, khi pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến.
Các pectin đều là những chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa

Thu dịch pectinase thô
Tủa protein
Pectinase
bán tinh
khiết
Cấy giống
( C
2
H
5
OH 70 %,
(NH
4
)
2
SO
4
bão hoà
70% )
( pH
opt
= 4.5 )
( T
opt
= 50
0
C )
( Tỉ lệ: 5 nước : 1 khối
lượng canh trường )
Ly tâm

Trong nước chiết thường chứa một số lớn các chất phân tử thấp do sự hoà tan
các sản phẩm thuỷ phân của một tinh bột, cellulose, pectin trong quá trình
sinh trưởng của nấm mốc.
Nhiệt độ nước thường dùng 25-28
0
C. Sự hiện diện của một vài chất sát
trùng như formalin có thể ngăn ngừa hiện tượng nhiễm trùng. Dung dịch sau
khi chiết phải được làm lạnh ngay xuống 10-12
0
C để tránh nhiễm trùng và
bảo toàn hoạt tính enzyme.
Sau khi nghiền môi trường nuôi cấy bề mặt, cho vào đó lượng nước gấp
5 lần khối lượng canh trường trên để hoà tan protein – enzyme từ khối canh
Trang 13
trường. tiến hành lọc thô và lọc tinh bằng máy lọc chân không, thu dịch
lọc.Bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 4
0
C .
* Tủa protein:
Tủa enzyme bằng ethanol: có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ hoà tan
của protein trong dung môi, trong đó hằng số điện môi của dung dịch. Những
dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay dimethysulfoxide có thể ổn
định mối tương tác giữa các phân tử của dung môi với các phân tử protein,
giúp cho sự hoà tan của protein trong dung dịch. Các dung môi có hằng số
điện môi nhỏ ( acetone, ethanol…), làm giảm hằng số điện môi của môi
trường. Như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì
vậy, các enzyme – protein cũng như các chất có phân tử lượng thấp trong hệ
dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ kết tủa và lắng xuống. Độ hoà tan của
enzyme vào dung dịch ethanol – nước phụ thuộc vào nồng độ ethanol, nhiệt
độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme.

4
là khả năng kết tủa chọn lọc protein. Do đó sẽ loại bỏ được
nhiều enzyme không mong muốn trong dịch. Lưu ý khi sử dụng (NH
4
)
2
SO
4
là
phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để
tránh khả năng tăng nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất đi tính kết tủa
chọn lọc của nó, thậm chí còn có thể làm biến tính một số enzyme kém bền.
Hạn chế của phương pháp sử dụng (NH
4
)
2
SO
4
chính là mất thời gian, do nồng
độ (NH
4
)
2
SO
4
cao nên tỉ trọng của dung môi lớn, để kết tủa các protein cần
phải li tâm ở tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp. sau đó cần phải lọc muối khỏi chế
phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo và không thể thu hồi muối tái
sử dụng.


mặt của chất cảm ứng pectin. Ngoài ra các nguồn C, N, P có tác động rất quan
trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này.
Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đế khả năng sinh
tổng hợp enzyme pectinase ta thu được kết quả trên môi trường 6 cám gạo / 4
vỏ bưởi thì enzyme có hiệu suất thu nhận là cao nhất, với hoạt lực chung là
0. 9612 UI/ ml chế phẩm.
 Ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy:
Theo một số nghiên cứu, độ ẩm môi trường không nên vượt quá 60 % vì
vi khuẩn dễ phát triển sinh tạp khuẩn và môi trường khó thông khí. Nhưng
nếu độ ẩm chỉ 45 – 50 % thì môi trường sẽ khô nhanh, làm giảm thời gian
sinh trưởng của nấm mốc. Lúc này nấm mốc sẽ sinh bào tử mạnh, sự tạo
enzyme sẽ bị đình trễ, làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành. Trong thời
gian nuôi cấy, nên giữ ẩm môi trường khoảng 50 – 60 % và thông khí ở 90 –
100 %. Nhiệt độ thích hợp để nuối nấm mốc là: 30 – 32
0
C
Đối với Aspergillus niger nuôi phương pháp bề mặt, ngoài các yếu tố ảnh
hưởng trên còn cần phải xét độ tơi xốp ( độ thoáng khí) của môi trường nuôi
cấy.
III. ỨNG DỤNG:
Hiệu quả của việc sử dụng enzyme:
Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và
rượu vang cho thấy khi sử dụng enzyme pectinase cho hiệu suất nước quả và
chất lượng rượu vang rất cao.
Khi tiến hành ứng dụng enzyme trong sản xuất nước quả và sản xuất
rượu vang, người ta đặc biết quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định
đến hiệu quả enzyme: nguyên liệu và khả năng xay nghiền, làm nhỏ nguyên
liệu.
Trang 16
• Nguyên liệu: không phải tất cả các loại quả đều

quá trình oxi hoá và sự nhiễm vi sinh vật không thành vấn đề lớn. Nhưng nếu
xử lý enzyme trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm vi
sinh vật.
III.1. Làm trong các loại nước trái cây:
Các chế phẩm enzyme thuỷ phân pectin được
sử dụng trong sản xuất nước quả. Chúng được
dùng để làm trong nước quả ép hoặc điều chế nước
quả từ các nguyên liệu quả nghiền.
Cơ chế tác dụng của pectinase là phá vỡ
protopectin, chính nó là liên kết giữa các tế bào,
sau đó enzyme này tiếp tục phá vỡ nguyên sinh
chất tế bào và gây vỡ tế bào quả, giúp nước quả
từ các tế bào chảy ra dễ dàng.
Từ các loại quả, người ta thường chế biến thành các dạng nước quả
trong, nước quả đục và nước quả có thịt quả. Nhưng để được nước quả thành
phẩm, trước tiên phải chiết rút được dịch quả từ mô bì. Do đó hiệu suất chiết
rút dịch quả phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, độ nhớt của dịch quả,
độ chắc của thịt quả.
Việc sử dụng ezyme pectinase không những làm tăng lượng nước ép quả
mà còn là biện pháp giải quyết một cách hiệu quả vào dịp thu hoạch rộ trái
cây, lúc đem quả về cần chế biến nhanh, phương pháp tốt nhất là nghiền nhỏ
nguyên liệu. Các quả nghiền được đun nóng trong thùng ở nhiệt độ 40 –50
0
C,
chuẩn bị trước chế phẩm bằng cách hoà tan enzyme khô vào nước quả với tỉ
lệ với tỉ lệ 1/5, nhiệt độ nước khoảng 40 – 42
0
C. Tuy nhiên, việc xử lý pectin
bằng enzyme pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần
phải giữ một lượng pectin nhất định trong sản phẩm nước quả. Chính lượng

Trang 19
Trong quy trình sản xuất cà phê, vỏ cà phê dày có chứa nhiều pectin
gây khó khăn cho quá trình bóc vỏ. Do đó người ta dùng enzyme pectinase để
làm mềm vỏ cà phê, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách vỏ cà phê.
Enzym pectinase có tác dụng thủy phân pectin của thịt quả cà phê thành
oligogalacturonide là một loại oligosaccharide.
Khi được đưa vào hệ tiêu hóa,
oligogalacturonide có vai trò như là prebiotic
là nguồn dinh dưỡng cho các vi sinh vật có lợi
cho đường ruột phát triển. Chế phẩm thịt quả
cà phê lên men do dự án sản xuất có hàm
lượng tannin và caffein dưới mức cho phép và
có hàm lượng protein cao.
III.4. Một số ứng dụng khác
Ngoài các ứng dụng nói trên, enzyme pectinase còn được ứng dụng để làm
giảm kích thước hạt trong quá trình xay nghiền hạt đậu nành, làm tróc các loại
vỏ trái cây thuộc họ cam, quýt…, ngăn chặn hiện tượng lắng cặn trong quá
trình bảo quản, ứng dụng trong trích ly các dược liệu đông y ( thuốc bắc và
thuốc nam)…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 20
1. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên) cùng cộng sự - Công nghệ
enzym – NXB Đại học quốc gia Tp. HCM – 2004
2. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh
Tuyết – Thí nghiệm công nghệ sinh học_ Tập 2_Thí nghiệm vi
sinh vật học – NXB Đại học quốc gia Tp.HCM – 2003
3. Nguyễn Thị Minh – Luận văn tốt nghiệp Đại học_ Thu nhận
enzyme pectinase từ canh trường Aspergillus niger và sử
dụng trong công nghệ sản xuất nước quả - ĐH Tôn Đức Thắng
– 01/2009