ĐỀ TÀI
”Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định
kiểu gene của vi rút viêm gan B”
ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virút B (VGVR B) hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn
thế giới và luôn là một mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu và cũng
như của Việt Nam. Bệnh có tỷ lệ mắc cao và thường gây nên những hậu quả nặng nề
như viêm gan mạn, xơ gan và ung thư tế bào gan nguyên phát.
Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm vi rút viêm gan B (HBV), trong đó
có khoảng 350 - 400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số
người bị nhiễm HBV mạn tính này tử vong sớm vì những biến chứng là xơ gan
và/hoặc ung thư gan. (Lee và CS 1997)
Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao của vi rút viêm gan B, ước tính có
khoảng 10 triệu người mang HBsAg nên viêm gan vi rút B là vấn đề quan trọng của
sức khoẻ cộng đồng. Tỷ lệ mang HBsAg cao nhất là lứa tuổi từ 41-50 chiếm 18,7%
trong khi lứa tuổi có tỷ lệ thấp nhất từ 0-10 là 10,7 %. Nhưng tỷ lệ HBeAg(+)
/HBsAg(+) của lứa tuổi 0 - 10 là 91 %. Theo diễn biến tự nhiên, tỷ lệ mất HBsAg
hàng năm là 1-2%, và chuyển đổi huyết thanh HBeAg chung là 9,6%.
Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát
triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên chúng ta đã có
thể chẩn đoán được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử. Nhờ ứng dụng các kỹ thuật
về phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết được các hạn chế của các
kỹ thuật miễn dịch kinh điển. Các kỹ thuật sinh học phân tử này bao gồm các xét TỔNG QUAN
1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B
1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới.
Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm HBV, với ước lượng 350-400 triệu
người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính
này chết sớm vì xơ gan và/hoặc ung thư gan.
Ba phần tư số người mang HBV sống ở châu Á; tỷ lệ người mang HBV mạn
tính ở Trung Quốc và Ðông Nam Á ở mức cao từ 8% dân số trở lên. Nhiễm HBV
cũng phổ biến ở châu Phi hạ Sahara. Tỉ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng
Ðịa Trung Hải, Nhật Bản, và một phần Ðông Âu. Nhiễm HBV tương đối ít gặp, ảnh
hưởng dưới 2% dân số, tại phần lớn Tây Âu, châu Úc và châu Mỹ. Mặc dù vậy, hàng
năm có khoảng 300.000 người tại Hoa Kỳ và có đến một triệu người châu Âu bị
nhiễm bệnh.
Sự khác biệt về tỉ lệ lưu hành toàn cầu là do khác biệt về các đường lây truyền
HBV chính. Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như châu Á và Tây Phi, lây truyền
HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỉ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến
90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg dương tính. Cách lây truyền này cũng xảy ra
ở những vùng có tỉ lệ lưu hành thấp, chủ yếu là ở những người nhập cư từ các vùng có
bệnh lưu hành địa phương. Hơn nữa, nhiễm bệnh ở tuổi càng nhỏ, thì cơ hội trở thành
người mang HBV mạn tính càng cao.
Các chương trình tiêm chủng tuy thành công, nhưng vẫn thường gặp các trường
hợp mới nhiễm HBV tại nhiều nước có mức độ lưu hành địa phương cao, và có hàng
triệu người đã nhiễm siêu vi mà đối với họ những văc-xin hiện dùng không có tác
dụng. Do đó, can thiệp điều trị là phương án duy nhất đối với những người có bệnh
gan thật sự do nhiễm HBV.


Chuỗi dài nằm ngoài mang điện tích âm, tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài
có định là 3,2 Kb và mã hoá cho các thông tin di truyền của virút. Chuỗi ngắn nằm
trong, có cực tính dương thay đổi và chỉ bằng 50 – 80% chiều dài sợi âm. HBV có cấu
trúc đặc biệt nhỏ gọn, có được sự tiết kiệm trong cấu trúc bộ gene bằng cách sắp xếp
những miền giao của các gene: S, C, P và X cho nên có khả năng tổng hợp được nhiều
loaị Protein quan trọng của virút.

2.2. Sự phân bố các kiểu gene của HBV.
Có 2 cách phân loại HBV: Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype).
Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào
các kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg). Tuy nhiên những ý nghĩa
của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự phát triển của sinh học phân
tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên bộ gen của HBV và
phân loại HBV thành 8 kiểu gene được đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác nhau trên
8% của toàn bộ bộ gen HBV (Kidd-Ljunggren et al., 2002; Kramvis et al., 2005;
Norder et al., 2004; Okamoto et al., 1988; Schaefer, 2005).
Sự phân bố các kiểu gene của HBV phụ thuộc vào các vùng địa lý khác nhau.
+ Kiểu gene A chủ yếu ở Mỹ, bắc và trung Âu.
+ Kiểu gene B và C chủ yếu ở châu Á.
+ Kiểu gene D chủ yếu ở Nam Âu, vùng Địa Trung Hải và Ấn Độ.
+ Kiểu gene E chủ yếu ở châu Phi đặc biệt ở vùng hạ Sahara.
+ Kiểu gene F chủ yếu ở Nam Mỹ và Polynesia.
+ Kiểu gene G có ở Mỹ, châu Âu bao gồm các nước Pháp, Đức và Hà Lan.
+ Kiểu gene H chỉ có ở Nam và Trung Mỹ.
2.3. Các phương pháp xác định kiểu gene của HBV.
Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định HBV
genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), PCR - RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-
linked Immunoassay). Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau.
+ Phương pháp giải trình tự gene có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
Các mẫu huyết thanh của bệnh nhân bị nhiễm HBV và các mẫu huyết thanh của người
bình thường. Bao gồm:
+ 30 mẫu huyết thanh của người bị nhiễm HBV.
+ 15 mẫu huyết thanh của người bình thường không bị nhiễm HBV.
2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các sinh phẩm hoá chất chính.

Tên hoá ch
ất

Hã
ng s
ản xuất2.2.2.
Các
máy
và
thiết
bị
chính
.

Bio-rad (Pháp)
Heraeus (Mỹ)
Thommas Scientitic (Mỹ)
Dolphin (Mỹ)
Nuaire (Mỹ)
Sanyo (Nhật Bản)
Shelab (Mỹ)
Memmert (Đức)
Amerex Instrument (Đức)
Jeio – Tech (Hàn Quốc)
Analitika (Đức)
Applied BioSciences (Mỹ)

1. Hoá ch
ất

dùng trong PCR

dNTPs
Agarose
Loading Dye
TBE
Thang chuẩn ADN
Taq-ADN-polymerase
2. Hoá chất phục vụ giải trình tự gen
Big Dye Terminator V3.1
HiDi Formamid
Ethanol tuyệt đối Tách DNA từ các mẫu huyết thanh
của bệnh nhân
Nested -PCR
Điện di sản phẩm PCR2 trên thạch
Agarose kiểm tra
Nếu có band đặc hiệu cắt bằng enzyme
SspI

2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể.
* Tách chiết DNA theo protocol của nhà sản xuất:
Sử dụng kít tách triết DNA của QIAgene (Đức)và qui trình cụ thể như sau:
1. Cho 20l Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đó cho 200l huyết thanh mẫu
vào.

Trung tâm Sinh Y Dược học Học Viện Quân Y và xây dựng thành protocol của Phòng
Vi sinh vật và Các mầm bệnh sinh học. Sơ đồ qui trình

Đo nồng độ ADN
của mẫu nghiên cứu

Tính toán giá trị các thành phần
phản ứng PCR

Tạo hỗn hợp phản ứng

Nhân gen theo chu trình nhiệt đã
được tối ưu hoá

Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu

dNTP mix (5 mM) 2 0.2 mM

dNTP mix (5 mM) 4 0.2 mM

Primer pre16as(10pmol/l)

0.5 0.5 µM

Primer A (10pmol/l) 1 0.5 µM

Primer 590as(10pmol/l) 0.5 0.5 µM

Primer non A(10pmol/l)

1 0.5 µM

Primer 1865(10pmol/l) 1
Taq Polymerase (5U/µl) 0.2 1 unit Taq Polymerase (5U/µl)

0.2 1 unit
DNA template 3 N/a DNA template
3
N/a
Total 25 Total 50

3. Chu trình luân nhiệt như sau:
3.1. PCR vòng 1:
Chu trình gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4 bước:
Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng bức ở 94
0

điện di có kích thước khoảng 444 bp và 1 vạch là phần còn lại của sản phẩm PCR
vòng 2.
Protocol dùng FastDigest SspI []:
- 10X FastDigest buffer: 2μl
- FastDigest Enzym: 1μl
- PCR product: 10 μl
- Water, nuclease-free: vừa đủ 20μl
Ủ ở 37 trong 15 phút. Điện di trong agarose 1.5% kiểm tra band đặc hiệu.
Những mẫu nào có 2 vạch tương ứng với vị trí 444 bp và 80 bp thì là cắt.
2.3.4. Phản ứng cắt bằng enzyme TasI
Sử dụng enzym giới hạn FastDigest TasI để cắt sản phẩm PCR vòng 2. Protocol
dùng FastDigest TasI []:
- FastDigest buffer B: 2μl
- FastDigest Enzym: 1μl
- PCR product: 15 μl
- Water, nuclease-free: vừa đủ 30μl
Ủ ở 65
0
C lắc 650 vòng/phút trong 15 phút. Điện di trên thạch Agarose kiểm tra,
phân tích và xác định genotype dựa vào tính đa hình của các đoạn giới hạn.
2.3.2.6. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động
phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng
Sơ đồ qui trình:


C x 10 giây
50
0
C x 5 giây
60
0
C x 4 phút) x 25 chu kỳ.
4
0
C: forever
* Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye:
Tinh sạch BigDye ở sản phẩm PCR trên bằng Ethanol và EDTA theo quy trình
của BigDye Terminater v3.1 [21]:
+ Cho 5 μl EDTA nồng độ 125 mg vào tận đáy tube chứa sản phẩm.
+ Cho thêm 60 μl ethanol tuyệt đối vào mỗi phản ứng.
+ Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
+ Ly tâm 2500g x 30 phút ở 4
0
C
+ Bỏ nước nổi, thêm 60 μl ethanol 70% vào mỗi tube.
+ Ly tâm1650g x15 phút ở 4
0
C.
+ Bỏ nước nổi.
+ Làm khô bằng Vacum Dry trong 15 phút ở 45
0
C.
* Biến tính HiDi và chạy Sequening
Sản phẩm tinh sạch sau khi đã làm khô và hả hết hơi cồn, được thêm vào mỗi
tube 20 μl HiDi. Để ở 95

III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả Nested – PCR
Sau khi chạy phản ứng PCR1 sẽ cho đoạn gen có kích thước 580bp. Sử dụng
sản phẩm này làm DNA template cho phản ứng PCR2. Khi điện di sẽ cho band đặc
hiệu ở vị trí tương ứng 527bp. Kết quả cụ thể ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả điện di sản phẩm Nested - PCR
K
ết qủa

S
ố l
ư
ợng

T
ỷ lệ(%)

Có band đ
ặc hiệu

55

100

Không có band đ
ặc hiệu

0

0


Không c
ắt

22

40

T
ổng số

55

100
527bp

Nhận xét: Khi cắt bằng SspI có 60% số mẫu bị cắt thành 2 band tương ứng với
vị trí 440bp và 80bp. Có 40% số mẫu không bị cắt bởi enzym này. Như vậy 33 mẫu có
thể là genotype A hoặc B. Còn 22 mẫu không cắt thì kiểu gen là từ C đến H.
3.3. Kết qủa cắt bằng TasI
Bảng 3.3: Kết qủa cắt sản phẩm Nested-PCR bằng enzyme TasI
Genotype

S
ố l
ư
ợng


K
ết qủa

PCR
-

RFLP

B

15

15(=100%)

15

C

10

10(=100%)

10
Hình diagram genotype B