1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng
trƣởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt. Vì vậy các nhà chọn giống
đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu
quả cao nhất. Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của
việc chăn nuôi heo nhƣ: phẩm chất con giống, dinh dƣỡng, trình độ chăm sóc quản lý,
vệ sinh phòng bệnh…Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng.
Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót
của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nƣớc đã áp dụng nhiều chƣơng
trình chọn giống mới kết hợp với phƣơng pháp chọn lọc truyền thống. Ngƣời ta đã tiến
hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS). Theo
các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000),
Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể
estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh
sản của nái. Trong nƣớc đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát
hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và
cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005)
Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành
chăn nuôi. Đƣợc sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật
PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire”
1.2 Mục đích - yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Ứng dụng PCR để phát hiện sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và xác định kiểu
gen của nó trong quần thể.
1.2.2 Yêu cầu
Ly trích DNA từ mẫu máu và da tai
và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con. Trên một số loài động hữu nhũ,
prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone.
Prolactin đƣợc phân tiết từ các tế bào ƣa acid của tuyến não thùy theo máu di
chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin. Sự tiếp nhận này đƣợc
quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích. Bình thƣờng bất cứ heo mẹ, heo bố
hay heo con nào cũng phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp
nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hƣởng của hormone này. Sự xuất
hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin
receptor gene). 4
2.2.3 Cơ chế tác động của prolactin
Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor)
tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme
adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP.
c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, nhƣ tác động
vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác
phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn
đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng và cả
hoạt tác gen.
quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng
trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất
sinh sản hay tăng trọng cơ thể. Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này
kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo
(Vincent, 1998).
Ở heo gen PRLR đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 16. Gen này liên kết khá chặt chẽ
với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23). Để
xác định đƣợc tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR –
RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Trƣớc
ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng
enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này. Với cách này thì ông đã xác định đƣợc kích
thƣớc của các băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 và 76 bp. Trong đó, băng 110
và 90 bp đƣợc xác định là đa hình. Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp
đƣợc xác định là alen A, băng 110 bp đƣợc xác định là alen B. Gen PRLR có tính đa
hình rất cao. Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn
cắt cũng có nhiều kích thƣớc khác nhau. Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA,
AB, BB. Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan,
Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thƣớc heo con sinh ra đồng
đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB.
6
Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank
Locus SSU96306
Định danh Gen PRLR
Số truy cập U96306
Sinh vật Ngƣời và các động vật hữu nhủ
Tác giả Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Robic A., Rothschild M.F.
Trình tự 1- agcaggagaa cggcgaccgg ccggagaagg ctggcgcccc tgaaaccagc
formaline, urea…Hiện tƣợng biến tính do nhiệt độ xảy ra khi nhiệt độ nóng
chảy (melting temperature, T
m
) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trƣờng.
T
m
cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA. DNA chứa càng nhiều
G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết
hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng hơn để phá huỷ liên kết
này.
Hồi tính là hiện tƣợng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với
nhau theo nguyên tác bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép. Đặc
điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR
(polymerase chain reaction).
N
N
NH
N
NH
2
N
NH
NH
N
NH
2
O
N
Cytosine
Guanine
Thymine
8
2.3.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA
DNA đƣợc xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi. Đặc điểm
cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn
(semiconservative replication). Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời
của chuỗi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn đƣợc dùng
làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ
tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân
tử DNA con đƣợc hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ.
Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuỗi DNA mẹ nhờ enzyme
topoisomerase và protein DNA A. Trong quá trình sao chép các chuỗi tách
rời nhau dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các
liên kết hidro giữa các nucleotide. Nhiều loại helicase cùng họat động đồng
thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’. Các mạch
tách rời sẽ đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single
strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn
lại với nhau. Sự tái bản đƣợc khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có
bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ
các DNA polymerase. Sự thêm các nucleotide luôn theo hƣớng 5’– 3’. Tức
là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và
mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch. Trên mạch khuôn 3’- 5’
RNA primase, protein
DNA A…
Tháo xoắn, tách các mạch đơn, cố định mạch
đơn, tổng hợp mồi và kéo dài chuỗi. Hình 2.4: Sự nhân bản DNA
Mạch đƣợc tổng hợp
liên tục
Mạch đƣợc tổng hợp
từ các đoạn Okazaki 10
2.3.2 Gen, allen và sự đa hình của gen
2.3.2.1 Gen
Gen là một đoạn DNA có khả năng kiểm soát một chức năng hoặc một tính trạng
nào đó của cơ thể sống. Đoạn DNA có khả năng sao mã tạo ra mRNA (RNA thông
tin). Từ mRNA thông tin này có thể đƣợc mã hóa tạo ra protein. Protein là đơn vị cấu
tạo nên sự sống, mọi thành phần của cơ thể sống hầu hết đƣợc cấu tạo từ protein nhƣ
các men tiêu hóa, các hormone, các thành phần cấu tạo của tế bào… Có nhiều gen
không tham gia tổng hợp protein nhƣng nó có khả năng ức chế hoạt động của một gen
hay một tổ hợp gen khác. Những loại gen này rất phổ biến ở động vật và ngƣời.
Cấu trúc tổng quát của một gen động vật đƣợc phân chia thành hai vùng nhƣ sau:
vùng mã hoá và vùng điều hoà ở đầu 5’(Lê Đức Trình, 2001; Bùi Trang Việt, 2002).
Vùng mã hoá bao gồm một chuỗi lần lƣợt các exon và intron. Các exon là các vùng
gen mã hoá protein. Theo qui ƣớc ngƣời ta gọi nucleotide thứ nhất nơi khởi sự sao
chép là +1, nucleotide trƣớc đó là -1. Còn các intron là các vùng gen không mã hoá
acid amin. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra rõ chức năng của vùng này trong quá
locus trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền đƣợc đo bằng tần suất tái tổ hợp gen.
Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó, mà
ngƣời ta có thể đo đếm đƣợc – gen đó có thể xem là marker gen.
Việc lập bản đồ gen và việc chọn lọc marker hình thái nhƣ vậy tốn rất nhiều thời
gian, thậm chí hàng chục năm trời. Số lƣợng marker thu đƣợc theo kiểu chọn lọc này
rất ít và chỉ có ở qui mô hình thái. Do vậy ngƣời ta đã sử dụng marker isozyme đã làm
cho vấn đề thay đổi theo chiều hƣớng tốt hơn, nhƣng số lƣợng marker thu đƣợc cũng
rất ít không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu. Trong tình hình này thì DNA marker
đƣợc đề xuất (Tankley và ctv, 1980). Về căn bản thì bất cứ chuỗi mã DNA nào đƣợc
dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem nhƣ
một DNA marker. Nhƣng nó phải đảm bảo về tính ổn định, sự xuất hiện của nó phải
luôn luôn có sự xuất hiện của gen quan tâm.
2.3.2.2 Allen và sự đa hình của gen
Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen nhƣ sau: “ Allen là các dạng khác nhau của
một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tƣợng đƣợc ông khảo sát ở đây là đậu
Hòa Lan. Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di
truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền
và locus đƣợc hình thành thì allen đƣợc định nghĩa lại nhƣ sau: “ Allen là 12
các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một
nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”.
Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen. Gen có càng nhiều allen
thì tính đa hình càng cao. Mỗi allen đƣợc hình thành từ sự đột biến đoạn mã
di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trƣờng sống, các tác nhân vật lý,
hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép. Các đột biến này nếu tạo
thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ đƣợc duy trì và lan truyền
trong quần thể. Nhƣ vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến ( Bùi Chí Bữu
và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang
- 50 μg / ml cho một dung dịch sợi đôi
- 40 μg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn
Ví dụ: một OD
260 nm
= 0,9 sẽ tƣơng ứng với:
- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi bằng 0,9*50 = 4,5 μg
- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA bằng 0,9*40 = 3,6 μg
Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch có độ tinh sạch cao. Để kiểm tra
độ tinh sạch của DNA thu đƣợc ngƣời ta đo thêm giá trị OD 280 nm, ở bƣớc sóng này
protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhƣng các protein cũng hấp thụ ở bƣớc sóng 260
nm, do đó làm sai giá trị thật của acid nucleic có trong mẫu. Một dung dịch acid
nucleid đƣợc xem là sạch nếu có tỉ số OD
260 nm
/ OD
280 nm
nằm trong khoảng 1,8 – 2.
Nồng độ DNA trong mẫu đƣợc tính bằng công thức sau:
Nồng độ (ng / μl) = OD
260 nm
*62,9 - OD
280 nm
*36
2.3.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kích thƣớc của các đoạn
DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích
điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose
sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt
agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gelling). Giữa những hạt nhƣ vật có những lỗ rất nhỏ.
Tùy theo nồng độ của gel mà kích thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel
2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
2.4.2.1 Taq polymerase
Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các
mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch
DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq
polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus.
2 4 6 8 1 0
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Lặp lại n lần
94–95
o
C
72
o
C
45-56
o
C 15
Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA
khoảng 94
o
C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng
70 – 72
o
C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không
có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide.
16
2.4.2.5 DNA khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên
cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào,
các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn
mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm
việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn.
2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ
cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì
sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzyme dùng trong
phản ứng.
2.4.2.7 Nhiệt độ và pH
Những enzyme đƣợc sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự thay đổi nhiệt độ có
ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì
khoảng nhiệt độ từ 94 – 95
o
C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt
lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 72
o
C, đây là nhiệt độ tối
ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định
nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng
nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56
o
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng tap polymerase
2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài
không đặc trƣng
Giảm thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Giảm thời gian kéo dài
Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68
o
C
Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn
giữ nồng độ MgCl
2
ở mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 nM, nhƣng
vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase 18
3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào
phản ứng
Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với
việc cấp rã đông.
Gia tăng hàm lƣợng mồi
Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số
lƣợng và kích thƣớc thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngƣợc lại, nếu có xuất
hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự
khác nhau về các băng DNA.
Các bƣớc để tiến hành kỹ thuật RFLP:
Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA
Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra
Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu đƣợc với enzyme cắt
Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid
Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp
Xác định kích thƣớc của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện
Southern blot và đƣa ra kết luận
Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý
enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thƣớc rất khó
phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không
dễ gì phát hiện ra đƣợc sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận đƣợc hình ảnh là một
dải liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa
hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng.
2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction
fragment length polymorphism)
Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng
một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình
DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ
thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc.
Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau
của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự
đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các
giai đoạn sau:
…GCCGG C…
Enzyme Eco52I
…AG CT…
…TC GA…
Enzyme AluI
Enzyme BalI 21
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT
3.1 Thời gian, địa điểm
3.1.1 Thời gian
Khóa luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08
năm 2005.
3.1.2 Địa điểm
Lấy mẫu máu, da tai tại trại giống Đông Á, huyện Dĩ An tỉnh Bình Dƣơng.
Tiến hành xét nghiệm mẫu để phát hiện gen thụ thể prolactin tại Trung Tâm
Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2 Đối tƣợng khảo sát
Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống.
3.3 Nội dung thực hiện
Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai.
Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống.
Phân tích kiểu gen của các heo giống
Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin
3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm
Vật liệu
Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu máu và mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái
ETDA.
Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng.
Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70
o
C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20
o
C.
khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích.
23
3.4.2.2 Ly trích DNA
Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu
của Roe và ctv, 1998)
1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm
400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10
o
C, lấy cặn.
2. Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở
10
o
C, lấy cặn.
Lặp lại bƣớc này cho đến khi phần cặn trở nên trắng.
3. Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS
C.
11. Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55
o
C qua đêm, vortex cho tan cặn.
Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20
o
C hoặc sử dụng ngay.
Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 đƣợc
Lê Thị Thu Phƣơng (2004) điều chỉnh)
1. Cho khoảng 5 mm
3
da vào eppendorf 1.5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 24
2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS,
pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml). Ủ hổn hợp ở 55
o
C trong 1 giờ.
3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây.
4. Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex
nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C.
5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml
ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20
o
C trong 2 giờ.
6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
280 nm
*36
DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm
trong khoảng 1,8 – 2.
3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen
PRLR
3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn
Xây dựng qui trình phản ứng PCR
o Xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR 25
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version
2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer:
Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’
Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’
Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng
4
o
C. Vincent (1998) đã đƣa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này
để thực hiện phản ứng PCR. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí
nghiệm của nƣớc ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi
tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng
3.1)
Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR
Qui trình 1 Qui trình 2
Bƣớc Nhiệt độ (
o
C) Thời gian (giây) Nhiệt độ (
o
Qui trình 2 là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc
thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng
đại học Nông Lâm TP. HCM
o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR
Copyright: Tài liệu đại học ©