1

THÍ NGHIỆM VI SINH
BÀI 1
CÁC QUI TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
Sinh viên tham gia thực tập vi sinh cần tuân thủ một số qui tắc sau để
đảm bảo an toàn:
1. Mặc áo blouse trong thời gian thực tập.
2. Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ
trách thực tập.
3. Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, phương pháp thí
nghiệm với vi sinh vật.
4. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. Không đưa vật thể
bên ngoài vào miệng khi đang thao tác với vi sinh vật.
5. Chỉ mang những vật dụng tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu thực tập,
tập ghi, bút) vào chỗ làm thí nghiệm. Tất cả các vật dụng cá nhân khác
phải để ở vò trí cách ly riêng.
6. Trước khi bắt đầu làm thí nghiệm, sinh viên cần sát trùng mặt bàn thí
nghiệm bằng khăn giấy tẩm cồn 70
o
và để khô. Thực hiện khử trùng
tương tự cho 2 tay của người làm thí nghiệm. Sau khi hoàn thành thí
nghiệm, tắt đèn cồn, sau đó lặp lại việc sát trùng mặt bàn và 2 tay với
cồn như trên.
2

7. Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử
dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác.
8. Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các đóa petri,
ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy.

đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, nguồn nitơ, khoáng đa lượng và vi
lượng cần cho sự biến dưỡng vật chất và năng lượng của vi sinh vật quan
tâm. Ngoài các thành phần dinh dưỡng cần thiết, môi trường còn cần có hàm
lượng nước thích hợp, độ pH xác đònh và có kết cấu lý tính thích hợp cho sự
tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu.
Người ta thường gọi tên các môi trường bằng cách dựa vào tên người
tìm hoặc gọi theo nguồn chất dinh dưỡng chính của môi trường.
Dựa vào tính chất vật lý, người ta có thể phân biệt thành các loại môi
trường dinh dưỡng sau đây:
- Môi trường lỏng: được dùng để nuôi tăng sinh, thử nghiệm các đặc tính
sinh lý và sinh hóa, giữ giống và bảo quản giống…
- Môi trường rắn: được dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu các
đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm tăng trưởng, đònh lượng mật độ
vi sinh vật, cấy chuyền, giữ giống…
- Môi trường bán rắn: được dùng trong lên men vi sinh trong công
nghiệp.
2. Vật liệu:
- Cốc thủy tinh
4

- Bình tam giác
- Ống nghiệm
- Phễu thủy tinh
- Ống hút
- Ống đong
- Cân
- Lò viba
- Nồi hấp áp lực
- Các hóa chất pha môi trường
3. Thực hành:

6

BÀI 3
PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG
1. Nguyên tắc:
Khử trùng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một số tác nhân lý
hóa như: nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất.
- Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do tác dụng làm biến tính
enzyme, mất nước và oxy hóa các thành phần của tế bào; nhiệt độ thấp
ức chế sự tăng trưởng của chúng. Có thể khử trùng bằng phương pháp
nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm.
- Năng lượng chiếu xạ ở bước sóng ngắn có khả năng ion hóa phân tử
nước tạo gốc tự do tác dụng phá hủy DNA, màng lipid và protein trong
tế bào; tia xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng
ion hóa nhưng có thể cảm ứng việc tạo thành dimer giữa các base

o
C hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết
không khí ra khỏi nồi cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục,
đóng van lại.
- Khi áp suất nồi trong lên đến áp suất cần hấp, bắt đầu tính thời gian
hấp.
8

- Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống
giá trò 0 mới được mở nắp để tránh gây tai nạn hoặc tránh áp suất thay
đổi đột ngột làm hư môi trường.
Sau khi hấp khử trùng xong, cần lấy sớm dụng cụ, bình chứa môi
trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng của
nhiệt lên môi trường. Các bình chứa môi trường có thể được làm nguội nhanh
dưới vòi nước chảy.
Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được
khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt, nhưng đảm bảo cho
phép không khí và hơi nước thông qua bằng cách sử dụng nút bông không
thấm nước, nắp nhôm, giấy nhôm…
Thông thường, các đóa petri hoặc nút bông còn được bao gói bằng giấy
hoặc giấy nhôm để giảm thiểu nguy cơ bò nhiễm sau khi khử trùng. Sau khi
hấp, các đóa petri vô trùng cần được sấy khô trước khi dùng.
bông.
Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, người thao tác cần mang
găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay với cồn 70
o
hoặc các dung dòch diệt
khuẩn khác, tương tự tiến hành sát trùng bề mặt bàn thí nghiệm trước khi bắt
đầu thao tác vô trùng. Sau khi thực hiện xong việc cấy chủng, tiến hành sát
trùng tay và bề mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi ra khỏi phòng
thí nghiệm.
2. Vật liệu:
- Que cấy thẳng
- Que cấy móc
- Que cấy vòng
- Đèn cồn
- Mơi trường ni cấy
- Giống vi sinh vật
3. Thực hành:
a) Cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng:
- Sau khi khử trùng que cấy, dùng tay phải để mở nút bông, hơ
nóng miệng ống nghiệm, xoay vài vòng qua ngọn lửa.
- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, làm nguội
que cấy.
- Thu sinh khối bằng cách nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút
thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống nghiệm.
11

- Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông. Đặt ống nghiệm vào
giá đỡ. Đầu que cấy có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không
khí vô trùng gần ngọn đèn.
- Dùng tay trái lấy ống nghiệm môi trường mới, mở nút bông, khử

môi trường rắn trong đóa petri sao cho các tế bào riêng biệt tách nhau
ra. Sau khi được ủ, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn
riêng biệt.
- Phương pháp hộp trải hoặc hộp đổ: là phương pháp pha loãng liên tiếp
bậc 10 dòch chứa vi sinh vật thành các mức pha loãng khác nhau,
chuyển 0,1 ml dòch ở các bậc pha loãng phía sau lên bề mặt đóa môi
trường rắn hoặc 1 ml dòch tương ứng vào môi trường rắn đun chảy. Mỗi
tế bào riêng biệt sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn.
- Phương pháp loạt ống agar mềm: là phương pháp pha loãng liên tiếp
một dung tích dòch chứa chủng trong các ống môi trường agar mềm và
sau đó chuyển lên bề mặt môi trường nền trên hộp petri. Mỗi tế bào
riêng biệt ở những ống pha loãng phía sau sẽ tăng trưởng thành khuẩn
lạc đơn.
13

Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật
pha loãng trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường
đều đồng nhất.
Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ
bò nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác vô trùng.
2. Vật liệu:
- Que cấy vòng
- Que gạt thủy tinh
- Đóa petri
- Đèn cồn
- Cốc thủy tinh
- Pipetman
- Tủ ấm
- Giống vi sinh vật
3. Thực hành:

15 BÀI 6
QUAN SÁT VI SINH VẬT
1. Nguyên tắc:
Kính hiển vi là thiết bò cần thiết trong nghiên cứu hình thái và nhận
diện vi sinh vật. Kính hiển vi cho phép phóng đại và quan sát rõ, chân thật
các đối tượng vi sinh vật, các nội bào quan khác nhau. Dưới đây là một số
kính hiển vi thường gặp:
- Kính hiển vi soi nổi: là dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10
lần đến 60 lần, thường dùng trong quan sát và thao tác trên những vật
có kích thước tương đối lớn. Nguồn sáng thường được chiếu trực tiếp từ
phía trên xuống vật và phản xạ vào kính.
- Kính hiển vi quang học: là hệ thống dùng để phóng đại vi sinh vật kích
thước nhỏ. Độ phóng đại của kính có thể từ vài chục lần đến 2000 lần.
Cấu tạo kính gồm: thò kính, vật, thân kính, bàn mang mẫu vật, tụ
quang, hệ thống chiếu sáng, nút chỉnh thô và nút chỉnh tinh. Ánh sáng
của kính chủ yếu truyền từ đáy lên, xuyên qua mẫu để vào vật kính.
Ánh sáng được điều chỉnh bằng cách nâng hoặc hạ tụ quang, đóng
hoặc mở chắn sáng, tăng hay giảm ánh sáng hoặc xoay gương, dùng
gương lõm hay phẳng.
- Kính hiển vi huỳnh quang: kính được trang bò bộ nguồn các ánh sáng
kích thích có độ dài sóng khác nhau để kích thích tạo huỳnh quang.

giữa thò trường của kính.
- Chuyển sang vật kính X40, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
b) Quan sát vi sinh vật với vật kính X100:
- Mẫu được cố đònh trên phiến kính và nhuộm màu. Sau khi làm khô,
nhỏ một giọt dầu cèdre lên vết nhuộm và đưa mẫu lên bàn mang vật.
- Nâng tụ quang, mở chắn sáng.
- Hạ từ từ vật kính X100 sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu cèdre.
- Dùng nút chỉnh thô nâng từ từ bàn mang vật cho đến khi thoáng thấy
ảnh thì ngừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh chỉnh cho đến khi nhìn
thấy ảnh rõ nét.
18 BÀI 7
HÌNH THÁI VI SINH VẬT
1. Ngun tắc:
- Vi khuẩn: là các vi sinh vật đơn bào, có nhiều hình dạng khác nhau: hình
cầu, hình que, hình xoắn… Các tế bào vi khuẩn có thể ở dạng tế bào đơn


20 BÀI 8
NHUỘM VI SINH VẬT
1. Nguyên tắc:
Phương pháp nhuộm Gram phân biệt 2 nhóm vi khuẩn dựa vào khả năng
bắt màu với các thuốc nhuộm tím kết tinh và iốt. 2 nhóm vi khuẩn này là:
- Các vi khuẩn Gram dương: giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh
và iốt khi xử lý bằng cồn.
- Các vi khuẩn Gram âm: không có khả năng giữ được phức chất tạo thành

22 BÀI 9
ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT
1. Nguyên tắc:
Vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Sau đây là 2 phương pháp thông dụng:
a) Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu:
Mật độ các vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn có thể được xác định
bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Phương pháp này cho phép
xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu, nhưng phương pháp này
không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết và khó đạt được độ chính
xác cao.
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 – 3 mm, có một

lớn, nhằm hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Phương pháp đếm khuẩn lạc được thực hiện như sau:
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy
các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000…
- Tạo hộp trải hay hộp đổ. Ủ ở điều kiện nhiệt độ, thời gian thích hợp.
- Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu (M):
M = A x D / V (CFU/ ml)
A: số khuẩn lạc trung bình/ 1 đĩa petri
D: độ pha loãng
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa petri (ml)
2. Vật liệu:
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Ống hút
- Que gạt thủy tinh
- Buồng đếm hồng cầu
- Đèn cồn
3. Thực hành:
- Thực hiện làm mẫu để đếm số lượng vi sinh vật
24

- Thực hiện đếm vi sinh vật trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm
hồng cầu
- Thực hiện đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường nuôi cấy.