48
was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL. The cell
biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight)
after 14 culture days with inoculum size of 3 g.
3. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented
with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min,
aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L
bioreactor. The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight
(53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g.
4. The concentration of essential oil in cells reached maximum at
2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in
rhizome. The concentration of curcumin in cells reached maximum at
1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome.
There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture. The
concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry
weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome.
There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture. The
compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less
than that in rhizome. There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed
similar to rhizome. There was a biotransformation of sesquiterpene in
cell culture.
5. Essential oil could inhibit growth of B. cereus ATCC 11778 (31
mm), S. aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E. coli ATCC 25922
(18.33 mm). Overall, the antibacterial ability of essential oil derived
from culture cell was high.
RECOMMENDATION
1. More studies to enhance the accumulation ability of
bioactive compounds in Zedoary cells.
2. More studies in composition as well as bioactivities of
curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from
Zedoary cells.

ginsenoside…. Nghệ đen là loài thảo dược quý, không
độc, có chứa
các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu. Curcumin của nghệ đen
có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như
ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng;
curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp;
2
curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình
thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả
năng bảo vệ tế bào. Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và
kháng đột biến rất cao. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức
chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ng
ăn ngừa
đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào. Trong tự
nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian
dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc
biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân
công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự
nhiên còn dễ mắc
các bệnh như thối củ và đốm lá. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên
liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý
của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria
Roscoe) và khảo sát khả nă
ng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính
sinh học của chúng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy

17.67
a
S. aureus ATCC 6538
0 31.00
a
14.00
aFigure 3.14. Antibacterial ability of essential oil. A: E. coli ATCC 25922. B:
B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: control. TN: essential
oil of rhizome. TB: essential oil of cells

CONCLUSION AND RECOMMENDATION
CONCLUSION

1. The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8%
agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus
induction from leaf-base of in vitro Zedoary. The yellow compact and
friable callus were most suitable for cell suspension culture.
2. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented
with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min
46


lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồ
n tài liệu
tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và
sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế
bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn
nguyên liệu ổn định để chi
ết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng
làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành
các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32
trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7
4
trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết
luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án:
1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng
tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình.

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng
Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2)
Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in
vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen.
Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh đượ
c công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh
lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra

culture, producing different sesquiterpene types compared with the
rhizome control.
Table 3.17. Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and
suspension cells of Zedoary at different culture times
Compound number/retention time (min)
Culture
time
(day)
1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7
2 2.11 - 2.49 5.99 -
trace trace trace
-
4 1.93 - 2.23 5.76 -
trace trace trace
-
6 1.15 trace 2.81 3.17 -
trace
- - -
8 1.06 - 1.54 3.57 - - - - -
10 1.22 - 1.02 4.05 -
trace
trace - -
12 1.04 trace 2.14 3.29 -
trace
-
trace
-
14 2.55 1.59 - 7.33 -
trace
-

không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L. Hệ lên men là một hệ thống nuôi
cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi
trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào
và/hoặc hình thành sản phẩm.
Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong
thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản
sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi
khuẩn; kháng virus Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều
trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo
mùi, thuốc trừ sâu. Các hợp chất thứ cấp của thực v
ật có thể phân thành
ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen.
Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã
được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều
quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công
nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp.
Những thành tựu
đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để
sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản
xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid,
saponin, phenol, flavonoid và các amino acid.
Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào
những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong
những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nh
ất đó là nuôi cấy tế bào
cây sâm Ngọc Linh. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế
bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa
6
cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu
bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene;

ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L
43
speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18
alongs to cell growth (Figure 3.9). Overall, concentration of curcumin
in culture cell with diferent culture time was higher than that in
rhizome (0.43%).
Bảng 3.16. Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor
Culture time
(day)
Retention time
(min)
Peak square
(mAU)

Curcumin
concentration (%)
2 2.09
1909 0.44
g
4 1.98
2226 0.52
e
6 2.05
2285 0.53
e
8 2.00
2442 0.56
e
10 1.97
4244 0.98

Concentration of polysaccharide
(%)
2 1.73
e
4 2.23
d
6 3.53
cd
8 5.15
bc
10 6.55
a
12 5,76
b
14 4.53
c
16 2.01
d
18 1.60
e
Rhizome 9.46
g
3.4.3. Curcumin
Analysis results of HPLC were performed in Figure 3.10-3.12 and
Table 3.16. Standard curcumin has a retention time of 2.05 mins, one
another peak has a similar retention time was found in extractive
solution of rhizome (2.08 mins) and cells were cultured within
different time 2-18 days (1.97-2.09 mins). Besides, extractive solution
of natural Zedoary performed 2 other peaks. Of them, one peak had
retention time that was similar to the second peak of culture cell (1.79

0
C cho đến khi khối lượng không đổi và cân.
2.2.4. Định lượng tinh dầu
Tách chiết và xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp của
Manzan và cs 2003.
2.2.5. Định lượng curcumin
Tách chiết curcumin theo phương pháp của Paramapojn và
Gritsanapan (2009). Phân tích HPLC để xác định hàm lượng curcumin
được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng
chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số
Tách chiết polysaccharide theo phương pháp của Sun và cs
(2005). Xác định hàm lượng polysaccharide dựa vào đường chuẩn D-
8
glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số
chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007.
2.2.7. Xác định sesquiterpene
Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004.
Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy
Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình
ChromQuest (ver. 4.2.34).
2.2.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương
pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) .
2.2.9. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thự
c nghiệm được
tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05)
bằng chương trình SAS.


3.0 583.33
b
50.33
a
3.5 441.00
d
33.17
b

Figure 3.9. Growth of Zedoary cell in 10 L bioreactor
3.4. The accumulation of some bioactive compounds in
Zedoary cells
3.4.1. Essential oil
Concentration of essential oil derived from Zedoary cells cultured
in 10 L bioreactor was showed in table 3.14. Overall, concentration of
essential oil (% dry weight) of cells increased from 2 to 14 culture
days and reached a peak 2.57% (1,61% in natural Zedoary rhizomes).
Table 3.14. Concentration of essential oil in Zedoary cells
Time (days) Concentration of essential oil (%)
2 1.41
c
4 1.49
c
6 1.57
bc
8 1.98
c
10 2.32
b
12 2.42

b

3.3.2.2. Agitation speed
This research showed that, the increase of agitation speed 100-150
rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got
peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight). However, at the higher
agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh
weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12).
Table 3.12. Effects of agitation speed on cell growth
Agitation speed
(rpm/min)
Fresh weight (g) Dry weight (g)
100 435.67
c
38.19
c
120 514.67
bc
47.97
b
150 561.00
a
50.84
a
180 547.33
b
50.03
a
200 437.00
c

3,0 3,0 10,20
d
+++ Trắng, mọng nước
4,0 4,0 8,20
cd
+ Trắng, mọng nước
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:
sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus. Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp,
(B) callus trắng và mọng nước
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus
2,4-D
(mg/L)
BA (mg/L)
Sinh trưởng
của callus
Hình thái callus
0,25 0,25 + Trắng và mọng nước
0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc
1,00 1,00 ++ Trắng và xốp
2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước
4,00 4,00 - Hóa nâu và chết
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:
sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng.


khố
i đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và
7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và
1,44. Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có
cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt,
dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu
39
3.3. Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor
3.3.1. Assessment of cell growth
Study showed that cell mass got maximum on the 14
th
with 241.67
g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased. The fresh cell
biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days
of culture.

Figure 3.7. Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor

Figure 3.8. Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B)
Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects
of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days.
3.3.2. Effects of culture conditions
3.3.2.1. Inoculum size
Results showed that the inoculum size effected on cell growth.
Biomass increased when supplementing 100-200 g of cell and got pick
at 514.64 g fresh weight (47,97 g dry weight). However, when
increasing the inoculum size up to 250 g, cell growth was depressed
(441 g fresh weight and 38.89 g dry weight) (Table 3.11).
38
from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a

2.57
60 8.40
a
0.62
a
2.80
70 7.65
b
0.57
b
2.55
Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3%
sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120
rpm/min. The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44
g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
2
4
6
8
10
12
024681012141618
Dry cell weight (g)
Fresh cell weight (g)

G
I
F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I

2 2,22
c
0,18
d
1,11 3,14
d
0,28
c
1,05 4,07
c
0,32
b
1,02 5,20
d
0,39

b
1,24 5,61
c
0,44
c
1,12
8 3,30
b
0,30
b
1,65 4,53
b
0,38
b
1,51 5,65
b
0,40
b
1,41 6,09
c
0,47
b
1,22
10 3,50
b
0,33
b
1,75 4,92
b
0,40

b
2,00 5,61
a
0,41
a
1,87 6,12
a
0,46
a
1,53 5,68
c
0,41
c
1,14
16 4,12
a
0,37
a
2,06 5,21
b
0,37
b
1,74 5,20
b
0,35
b
1,30 5,00
d
0,32
cd

(0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu
vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơ
n 150-180 vòng/phút,
tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút,
sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào
chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào
Tốc độ lắc (vòng/phút) F
W
D
W
G
I

80 5,00
ab
0,34
c
1,67
100 5,61
b
0,41
b
1,87
120 5,91
a
0,44
a
1,97
150 5,60

0,46
a
2,08
1,0 5,76
b
0,42
ab
1,92
1,5 5,92
b
0,37
b
1,97
2,0 5,41
bc
0,35
b
1,80
2,5 4,55
bc
0,32
b
1,52
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D
Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ
sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở
bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có
ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô)
và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào

b
2,01
2,5 5,35
c
0,36
c
1,78
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA
Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và
2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được
trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh sinh trưởng tế bào
2,4 D (mg/L) BA (mg/L) F
W
D
W
G
I

0,5 0,25 5,82
b
0,43
b
1,94
0,5 0,5 5,91
b
0,44
b
1,97
0,5 1,0 5,32

b
0,46
b
2,07
1,5 0,5 7,22
a
0,55
a
2,41
2,0 0,5 6,03
b
0,43
b
2,01
2,5 0,5 6,01
b
0,42
b
2,00
37
culture were showed in figure 3.8.
Table 3.8. Effects of sucrose on cell growth
Sucrose (g/L) F
W
D
W
G
I
20 7.22
c

medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically
(10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of
3.48, the suspension solution was bright yellow and rather
homogenous. At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth
decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry
weight).
3.2.4.2. Effects of glucose
Results indicated that cell biomass was rather low when culturing
cells on medium contain 20-30 g/L glucose. At the glucose of 40-60
g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry
weight), with growth index of 2.44. At the glucose of 70 g/L, the cell
growth was depressed.
Table 3.9. Effects of glucose on cell growth
Glucose (g/L) F
W
D
W
G
I

20 3.15
cd
0.22
c
1.05

30 6.05
c
0.42
bc

weight) and growth index was 2.25, higher than other medium.
Table 3.6. Effects of 2,4-D on cell growth
2.4 D (mg/L) F
W
D
W
G
I

0.25 5.10
c
0.42
b
1.70
0.5 5.77
b
0.43
b
1.92
1.0 6.02
b
0.45
b
2.01
1.5 6.75
a
0.52
a
2.25
2.0 6.04

b
1.94
0.5 0.5 5.91
b
0.44
b
1.97
0.5 1.0 5.32
c
0.40
c
1.77
0.5 1.5 5.00
c
0.39
c
1.67
0.5 2.0 4.45
cd
0.38
c
1.48
0.5 2.5 4.00
d
0.35
c
1.33
0.25 0.5 5.12
c
0.39

containing 2,4-D 1.5 mg/L and BA 0.5 mg/L, with 7.22 g fresh weight
(0.55 g dry weight) and 2.41 respectively.
3.2.4. Effects of carbon sources
3.2.4.1. Effects of sucrose
Effects of
sucrose on the growth of Zedoary cells after 14 days of
13
Nhìn chung, môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết
quả tốt hơn các môi trường bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế
bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5
mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41.
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose
Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau
14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng tế bào
Sucrose (g/L) F
W
D
W
G
I
20 7,22
c
0,55
b
2,41
30 10,44
a
0,66

3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose
Kết quả cho thấy, tế bào có sinh khối tương đối thấp khi được
nuôi trong môi trường có 20-30 g/L glucose. Ở nồng độ glucose từ 40-
60 g/L sinh khối tăng lên và đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ
số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng dộ 70 g/L đã ức chế sinh
trưởng của tế bào.
14
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng tế bào
Glucose (g/L) F
W
D
W
G
I

20 3,15
cd
0,22
c
1,05

30 6,05
c
0,42
bc
2,02

40 7,12
a
0,53

W
G
I

20 6,72
b
0,35
c
2,24
30 7.34
b
0,55
b
2,45
40 7,70
ab
0,57
b
2,57
50 7,72
ab
0,59
b
2,57
60 8,40
a
0,62
a
2,80
70 7,65

The results were showed in table 3.4. Overall, the shaking speed
also affected on biomass. At the speed of 80-120 rpm/min, biomass
increases and got the maximum of 5.91 g fresh weight (0.44 g dry
weight), growth index was 1.97 and the solution of cell suspension
was bright yellow, homogenous. When the speed increased to 150-180
rpm/min, cell growth was slower, depressed especially at 180
rpm/min, the best biomass was 4.75 g fresh weight (0.35 g dry weight),
solution of cell suspension become brown after 14 days of culture.

Table 3.4. Effects of shaking speed on cell growth
Shaking speed
(
rpm/min)
F
W
D
W
G
I

80 5.00
ab
0.34
c
1.67
100 5.61
b
0.41
b
1.87

0.45
a
2.06
0.5 6.25
a
0.46
a
2.08
1.0 5.76
b
0.42
ab
1.92
1.5 5.92
b
0.37
b
1.97
2.0 5.41
bc
0.35
b
1.80
2.5 4.55
bc
0.32
b
1.52
3.2.3.2. Effects of 2,4-D
The growth ability of the Zedoary cells on the culture medium

F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I
F
W
D
W
G
I

2 2.22
c
0.18
d
1.11 3.14
d
0.28
c
1.05 4.07
c
0.32

b
1.33 4.94
c
0.37
b
1.24 5.61
c
0.44
c
1.12
8 3.30
b
0.30
b
1.65 4.53
b
0.38
b
1.51 5.65
b
0.40
b
1.41 6.09
c
0.47
b
1.22
10 3.50
b
0.33

1.44
14 4.00
a
0.35
b
2.00 5.61
a
0.41
a
1.87 6.12
a
0.46
a
1.53 5.68
c
0.41
c
1.14
16 4.12
a
0.37
a
2.06 5.21
b
0.37
b
1.74 5.20
b
0.35
b
Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác đặt trên máy lắc
3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men
3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày
thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh
khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi.
0
5
10
15
20
25
0
50
100
150
200
250
300
024681012141618
Khối lượng khô tế bào (g)
Khối lượng tươi tế bào (g)
Thời gian nuôi cấy(ngày)
Khối lượng tươi tế bào
Khối lượng khô tế bào

a

250 441,00
b
38,89
b

3.3.2.2. Tốc độ khuấy
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100-
150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561
g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì
sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g
khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào
Tốc độ khuấy (vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
100 435,67
c
38,19
c
120 514,67
bc
47,97
b
150 561,00
a
50,84
a
180 547,33
b
50,03

3,5 441,00
d
33,17
b
33 Figure 3.1. Callus induction culture of Zedoary. (A) White and soft callus, (B) White
and viscous callus
Table 3.2. Effect of hormone on growth and morphogenesis of callus
2,4-D
(mg/L)
BA
(mg/L)
Callus growth
Callus morphogenesis
0.25 0.25 + White and viscous
0.50 0.50 ++++ Light yellow, compact and friable
1.00 1.00 +++ White and soft
2.00 2.00 ++ White and viscous
4.00 4.00 - Brown and dead
++++: high growth of callus; +++: medium growth of callus; ++: low growth of
callus; +: weak growth; - : no growth.


suitable (rate of callus induction as 40.1-46.01%), callus was white,
soft and good growth (Figure 3.1A). On other medium, the rate was
low (8.2-15.74%), callus was white and viscous (Figure 3.1B).
Table 3.1. Callus induction and morphogenesis of Zedoary leaf-base
explants
2,4-D
(mg/L)
BA
(mg/L)
% explants
produced
callus
Callus
induction
Callus
morphogenesis
0.0 0.0 - - -
0.5 0.5 15.74
c
++ White, viscous
1.0 1.0 46.01
a
++++ White, soft
2.0 2.0 40.10
b
++++ White, soft
3.0 3.0 10.20
d
+++ White, viscous
4.0 4.0 8.20

trong tế bào nghệ đen
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men 10
l được trình bày ở bảng 3.14. Nhìn chung, hàm lượng tinh dầu (% khối
lượng khô) của tế bào tăng dần từ 2-14 ngày nuôi cấy và đạt giá trị cực
đại là 2,57% cao hơn của củ nghệ đen tự nhiên (1,61%) khoảng 1,6 lần
(p<0,05).
Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào nghệ đen
Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng tinh dầu (%)
2 1,41
c
4 1,49
c
6 1,57
bc
8 1,98
c
10 2,32
b
12 2,42
b
14 2,57
a
16 1,68
bc
18 1,09
d
MTN (củ nghệ đen 1 năm tuổi) 1,61
c
18

2,01
d
18
1,60
e
MTN
9,46
g
3.4.3. Hàm lượng curcumin
Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và
bảng 3.16. Curcumin chuẩn có thời gian lưu là 2,05 phút, một peak có
thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch chiết của củ
nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian khác
nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Bên cạnh đó, dịch chiết của củ
nghệ đen tự nhiên còn có thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu
như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấ
y (1,79 phút), peak còn lại có thời
gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy có một peak thứ ba rất
nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của peak thứ ba
1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có
thể là do sự chuyển hóa sinh học đã xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.16 cho thấy,, hàm lượng curcumin
(theo % khối lượng khô) tăng dầ
n từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14, đạt
31
stored liquid of MS environment including 3% sucrose, added 1.5 mg/L
2,4-D and 0.5 mg/L BA, sample amount of 100-250 g, agitation speed
of 100-200 rpm/min, aeration rate of 1.5-3.5 L/min. The cell mass was
collected every two days during 18 days to study their growth ability.
2.2.3. Determination of the cell growth

There have been some studies in in vitro multiplication of the
curcuma such as regenerating buds from callus of Zedoary. Overmore,
some initial results in culturing callus and cell suspension of the
curcuma have been published already. Up to now, there have been no
any studies of cell culture of the Zedoary in fermentation system as
well as no any assessment in their ability in accumulating bioactive
compounds.

Chapter 2
RESEARCH OBJECTIVE AND METHODS
2.1. Research objective
The objective was C. zedoaria Roscoe. The materials were callus
from leaf-base of in vitro Zedoary.
2.2. Methods
2.2.1. Callus culture
Leaf-base of in vitro Curcuma zedoaria Roscoe were cultured on
the MS medium supplemented with sucrose 2% and agar 0.8%; 0.5-4.0
mg/L 2,4-D; and 0.5-4.0 mg/L BA.
2.2.2. Cell suspension culture
2.2.2.1. Culturing cells in flask
2 g callus of two weeks age were transfered into flasks of 250ml
containing 50 mL of MS liquid medium supplemented with 2% sucrose,
0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, cultured on the shaking machine with
speed of 500 rpm/min. The liquid MS medium added variety of carbon
resources and hormones like BA and 2,4-D cultured on the shaking
machine with speed of 500 rpm/min to evaluate the ability of cells growth.
2.2.2.2. Cell suspension culture in bioreactor
100 g of cell mass was transfered to fermentation system of 10 L
19
cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của

4448 1,03
b
14 2,07
5034 1,16
a
16 1,99
3631 0,84
c
18 2,07
2573 0,60
d
MTN 2,06
1868 0,43
g Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin
chuẩn (0,5 mg/ml)

Hình 3.11. Phổ HPLC của dịch chiết củ
nghệ đen tự nhiên20 Hình 3.12. Phổ HPLC của dịch chiết tế

of most successful archivements is culturing ginseng Ngoc Linh.
Besides, there were some other cell culture of others medicinal plants
like Taxus Wallichiana zucc, Solanum hainanense, Centella asiatica,
vinca rosea Zedoary possess essential oil including sesquiterpene
and monosesquiterpene; curcuminoid. Moreover, the plant also stores
starch, plastic and some other bitterness compounds. Zedoary has been
utilized in some remedies of oriental medicine for treatment. Many
studies indicated that compounds like essential oil, curcumin,
sesquiterpene… of Zedoary possess precious bioactivities such as
28
and discussion, 36 pages; Conclusion and recommendation, 2 pages;
Publcation related to the thesis: 1 page. References: 23 pages
(including 193 English and Vietnamese references); 18 table of data
and 16 figures

Chapter 1
OVERVIEW
17 Vietnamese references and 189 English references were
refered, related to: (1) Plant cell culture; (2) Accumulation of
secondary metabolites in in vitro plant cell culture; (3) Introduction of
C. zedoaria Rocoe.
The first experience of plant tissue was published in 1902 by
Haberlandt-the German plant Physiologist, known as the man invented
method of plant cell culture. First experiments in single cell culture for
pharmaceutical production in 1950s in Charles Pfizer company. Up to
now, 1 century since Haberlandt research, many sub – substances were
produced via plant cell culture.
Plant cell culture started from appearance of unsplitting cells that
called callus. Callus culture was based on tissue culture taken from
plants on the essential culture environment including agar. The cell

6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - -
8 1,06 - 1,54 3,57 - - - - -
10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - -
12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết -
14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết -
16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - -
18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết -
MTN

6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19
22 Hình 3.13. Phổ HPLC về sự phân bố sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế
bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít từ 2-18 ngày
3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen
Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế
bào và củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của
cả 3 loài vi khuẩn E. coli, S. aureus và B. cereus. Nhìn chung, tinh dầu
27
4. Thesis contributions
- Successful selection of cell line (compact and friable) from the
leaf-base explants of in vitro Zedoary to culture suspension, along with
systematical identification of

macrophages, which has therefore the anti-inflammatory effects. Besides,
curcumin is also an antioxidant that is capable of cells protection.
Essential oil has the high capacity of antimicrobial and mutation
resistance. In addition, its polysaccharide effectively inhibited the growth
of sarcoma (sarcoma 180), preventing chromosome mutation, as well as
has macrophages stimulating activity.
In the nature, Zedoary is propagated by rhizome. The growth of
bulb takes place in a long time, leading to the less multiplier
coefficient and lower yield. On top of that, it especially depends
greatly on the conditions of weather, seasons, labor costs and
production materials. On the other hand, the natural Zedoary is also
susceptible to diseases such as root rot and leaf spot. It is, therefore,
very difficult to have a stable and abundant raw materials for the
production of a large number of precious activities used in
pharmaceutical preparations.
In the light of the above facts, we do the thesis of “Study on cell
culture of Zedoary (Curcuma Zedoaria Roscoe) and investigate the
accumulation of some bioactive compounds”.
2. Research purposes
Study to propose suitable culture conditions and medium for
quick production of cell biomass, simultaneously for identification
of the ability in accumulating some bioactive compounds in cells of
Curcuma zedoaria Roscoe that were from suspension culture.
3. Research contents
- Callus induction from in vitro leaf-base explants of Zedoary;
-
Suspension culture of Zedoary cells;
- Study the accumulation of some bioactive compounds in in
vitro Zedoary cells;
- Investigate of antibacterial activity of essential oil in

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen. A: E. coli ATCC 25922.
B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ
nghệ đen tự nhiên. TB: tinh dầu của tế bào nghệ đen
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN

1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung
thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ
bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu
vàng, rắn và rời rạc được dùng làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy tế
bào huyền phù.
2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5
mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh
24
trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực
đại là 10,44 g tươi (0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g.
3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5
mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí
2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên
men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14
ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g.
4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khố
i
lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ
nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt
cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin
ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Đã có chuyển hóa sinh học
curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng polysaccharide trong tế
bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi cấy, thấp hơn
ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự

about more than 80,000 compounds published. The exploitation of
natural resources of medicinal plants is becoming an important issue
globally as they are more increasingly commercialized. The question
is now that the natural habitats of medicinal plants are rapidly
disappearing due to fluctuations in environmental conditions and
geography, as well as the indiscriminate exploitation of human beings.
That is the reason why scientists must take into account the potential
of plant tissue culture technique as an alternative to a stable supply of
raw materials for the pharmaceutical industry.
Plant tissue culture has been researched since the 1950s. Many
studies showed that it is an effective method in producing bioactive
substances or their metabolites. Based on the method, a wide variety of
valuable compounds has been produced successfully, such as
anthraquinone, vincristine, berberine, diosgenin, taxol, ginsenoside,
and so on.
Zedoary is a non-toxic herb, containing the substances such as
curcumin, terpenoids and essential oils. Curcumin is capable of inhibiting
tumors, which helps to against some forms of cancer in mice, such as
colon cancer, stomach cancer, breast cancer and ovarian cancer. It has
also the effects of anti-clotting and hypotension. Both curcuminoid and