Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM


TRẦN THỊ KIM DUNG
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN
BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA
AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

LỜ I CẢM ƠN

Trướ c hế t, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thà nh và sâu sắ c tớ i TS. Trầ n Thị
Phương Liên – phòng Công nghệ ADN ng dng – Việ n Công nghệ Sinh họ c đã
tậ n tì nh hướ ng dẫ n và dì u dắ t tôi trong quá trì nh hoà n thà nh luậ n văn.
Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen
H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang
gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình
Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010.
Tôi xin chân thành cả m ơn lã nh đạ o Việ n Công nghệ sinh họ c và cá c thầ y cô
giáo trong khoa Sinh – KTNN, Trườ ng Đạ i họ c Sư phạ m Thá i Nguyên , Đạ i học
Thái Nguyên đ ging dạy và tạo điểu kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bà y tỏ biế t ơn tớ i toà n thể cá c cá n bộ Phò ng Công nghệ ADN Ứ ng
dng, Việ n Công nghệ sinh họ c , đặ c biệ t là PGS.TS. Nông Văn Hả i – Trưở ng
phòng Công nghệ ADN ng dng , KS. Hà Hng Hnh đã giú p đỡ và chỉ bả o tôi
rấ t tậ n tì nh trong suố t thờ i gian tôi thự c tậ p và thự c hiệ n luậ n văn vừ a qua.
Tôi xin chân thành cm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đ cung cấp nguyên
liệu bèo tấm cho luận văn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
NHƢ̃ NG TƢ̀ VIẾ T TẮ T

Amp Ampicilin
DNA Deoxyribonucleic acid
ATP Adenosine triphosphate
bp Base pair (cặ p bazơ)
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid
epp Eppendorf
EtBr Ethidium bromide
IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside
kb Kilo base
LB Luria – Bertani
PCR Polymerase Chain Reaction
RNase Ribonuclease
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SHPT Sinh học phân tử
TAE Tris – acetate – EDTA
X - gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide
v/p vò ng/pht Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Hoa của Lemna gibba
5
1.2
Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự
5
1.3
Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza
6
1.4
Sơ đồ cấu trc gen điển hình
11
1.5

bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi.
44
3.8
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%
45
3.9
Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%
47
3.10
Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme
48
3.11
Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 với dự
đoán các vùng chức năng promoter
49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC

Lời cam đoan
Những từ viết tắt
Danh mc các bng
Danh mc các hình

1.2.2. Cấu trc promoter
11
1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter
13
1.2.4. Phân loại promoter
13
1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật
15
1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm
17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
19
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U
21
2.1. Nguyên liệu
21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
21
2.1.2. Hóa chất
21
2.1.3. Thiết bị
22
2.2. Phương pháp nghiên cứu
22
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật
22
2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose

44
3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE
46
3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter.
48
KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ
53
TI LIỆU THAM KHẢO
54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
1
MỞ ĐẦU
Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên,
ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền
thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn
yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng
mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa
hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều
trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng không mong muốn.
Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục
được các hạn chế đó. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực
vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các
gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống
đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới
đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính
chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải
thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng. Công nghệ
gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản

khác nhau
Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm
Việt Nam phục vụ cho việc thiết kế tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi
ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài
bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2” với các nội
dung chính sau đây:
1. Hoàn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna
aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2;
2. Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển
biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela
polyrrhiza DB2 bằng PCR;
3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen
đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza
DB2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm
1.1.1. Phân bố của bèo tấm
Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật thủy sinh có khả năng
tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam
quanh năm giá lạnh. Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt của bèo tấm cũng
ít hơn. Trong các chi thuộc loài bèo tấm thì 3 chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) được
phân bố khắp thế giới, trong khi đó Wolffia ít tìm thấy ở châu Mỹ và châu Phi.
Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc
Mỹ và Đông Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mỹ
và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mỹ, Đông Nam Á và châu Úc. Lemna
aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng có khí hậu ấm áp trên thế giới.

điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất khoáng, rễ
sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn và
thậm chí có loại không hình thành rễ. Cấu trc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn
giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh.
Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác,
rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài,
và vùng các tế bào thuần thục.
1.1.2.3. Hoa và quả bèo
Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Chng thường
hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát thấy. Hoa của
các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tuỳ thuộc vào
loài. Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất. Các nhụy hoa
thường ngắn và khó quan sát hơn. Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp vỏ ngoài
khô, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường. Quả bèo thường
có dạng như một ti có răng cưa, đôi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ
1-6 hạt [36]. Hình 1.1 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
5

Hình 1.1. Hoa của Lemna gibba
1.1.3. Cây phân loại bèo tấm

Hình 1.2. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự
Theo Landolt, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia,
Woffiela với trên 40 loài khác nhau [36]. Ông đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và
kích thước của cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở
lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2
mm)…
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
7
một nửa so với ở 20
o
C. Trong giai đoạn ngủ, nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có
thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến vòng đời
của cánh bèo. Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng có thể làm cánh bèo già hoá nhanh
và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Có thể nói, vòng đời sẽ dài hơn khi tốc độ nhân lên của
cánh bèo nhỏ. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị
tổn thương và chết nhanh hơn bình thường [36].
1.1.4.2. Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa và tạo hạt tương tự như
các loài thực vật hạt kín khác. Với kích thước cánh bèo, hoa và hạt nhỏ bé, bèo tấm
được coi là loài thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong giới thực vật. Sinh sản hữu tính ở
bèo tấm bao gồm 2 giai đoạn: (i) Ra hoa và (ii) Tạo quả và hạt.
* Giai đoạn ra hoa: Cơ quan ra hoa ở bèo tấm L. aequinoctialis gồm các
thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị hoa, 1 nhụy hoa. Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan của
hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh
trong 1 xoang ở bề mặt trên của cánh bèo và không ở cung xoang phát sinh cánh
con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh. Hoa của Wolffiella nằm
ở cạnh đường trung tâm của cánh [36].
* Giai đoạn tạo quả và hạt: Sau khoảng thời gian từ 2 đến 5 tuần tính từ lc
thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và thường có 1 - 6 hạt. Ở hầu hết các
loài, quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L. perpusilla. Quả thường dài
từ 0,35 mm đến 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy đen ở đỉnh.
Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có thể ở dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích
thước hạt biến đổi trong cùng một loài và giữa các loài từ 0,3 – 2 mm về chiều dài
và 0,2 – 0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngoài và vỏ hạt trong, nội nhũ và
phôi. Vỏ ngoài gồm 2 – 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào
hơn ở giữa và cuối hạt [36].

Lemna minor 7115
126
5.82 / 12C
0.49
0.046
Wolffiella oblonga 79 (7166)
42
3.02 / 4C
0.76
0.072
Wolffia arrhiza 7347
42
6.53 / 4C
1.63
0.155
Gen ngoài nhân của bèo tấm bao gồm gen lục lạp và gen ty thể. Gen lục lạp
(cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Tháng 5
năm 2008, bộ gen lục lạp của Lemna minor đã giải trình tự hoàn chỉnh. Bộ gen lục
lạp có cấu trc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa
protein, 30 tRNA gen và 4 rRNA gen [42].
1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng
Bèo tấm có chứa các chất dinh dưỡng với sự đa dạng về cả thành phần và
hàm lượng. Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2… và các amino acid
không thay thế trừ methionine. Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các
loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao nhất. Hầu hết các loài
bèo tấm có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện
nuôi cấy [37]. Trong thời gian gần đây, đã có các nghiên cứu sử dụng bèo tấm như
là hệ thống sinh tổng hợp các chất thứ cấp, các sản phẩm mang lợi ích cho người
dân, các protein với hàm lượng lớn và hoạt tính sinh học cao…[38]. Các yếu tố ảnh
hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần

nhưng lại tiềm ẩn các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc virus do chng là ký chủ cho
nhiều loại virus gây bệnh cho người và gia sc. Do đó nhiệm vụ của các nhà sinh
học phân tử là tìm ra được các hệ thống sản xuất protein khác đảm bảo các yêu cầu:
rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus.
Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế
trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycoside hóa
các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các
phản ứng miễn dịch. Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an
toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao. Thứ ba là lợi thế về giá thành,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
10
thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm
sóc và nguyên liệu đầu vào.
Trong các loài thực vật được nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài
thuộc họ bèo tấm đang được đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng
sinh khối nhanh. Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đôi trọng lượng trong
vòng 24 – 72 giờ. Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với
các loài thực vật khác. Đối với cây ngô, từ 1 g chất khô ban đầu, sau một tuần
không thể tạo ra lượng chất khô lớn hơn 2,3 kg. Trong khi đó một số loài bèo tấm
lại có thể tạo ra 64 g chất khô từ 1 g chất khô ban đầu sau 1 tuần [31], [50].
Mặt khác hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao với sự đa dạng
về thành phần các vitamin (A, B1, B2…), các amino acid không thay thế. Riêng
protein của bèo tấm có thể đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khô tuỳ theo loài [36], tức
là tỷ lệ tương đương với đậu tương. Theo tính toán, chỉ cần 1 - 3 % tổng số protein
nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đủ để bèo tấm được coi là hệ thống tái
sinh hiệu quả. Do những ưu điểm đó, trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên
cứu chuyển gen để sản xuất các hoạt chất sinh học từ bèo tấm. Các nhà khoa học
Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế,
nhằm sản xuất các hoạt chất sinh học khác nhau trong đó có vacine. Quy trình
chuyển gen vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp gen ở một số loài

biểu hiện gen như enzyme RNA polymerase, các nhân tố phiên mã (transcription
factor – TF). Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay
“promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal
promoter hay minimal promoter ) và “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía
trên TSS) (distal promoter) có thể được sử dụng. Cả hai loại promoter gần và xa đều
chứa rất nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hòa
phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, cơ quan, giai đoạn phát triển và môi trường [3], [53].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
12

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn [69]
Về mặt cấu trc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc
trưng có chức năng bám/gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên
mã gen. Các nhân tố điều hòa (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một
sợi với vùng mang mã của gen được gọi các nhân tố Cis (cis elements) [16]. Mỗi
yếu tố được đặt tên dựa trên cơ sở trình tự nucleotide của chng. Yếu tố cis cơ bản
nhất là hộp TATA (TATA box), được tìm thấy ở hầu hết các gen sinh vật nhân
chuẩn, nằm ở vị trí -30 (nằm về phía trước vị trí khởi đầu phiên mã (vị trí +1) 1
đoạn 30 nucleotide). Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thường nằm ở quanh vị trí -10.
Ở sinh vật nhân chuẩn có các nhóm promoter tương ứng với ba loại enzyme RNA
polymerase I, II và III. Promoter nhóm II bao gồm các promoter của các gen hoạt
hoá cho sự phiên mã mRNA và một số loại small RNA, U
1
, U
2
, U
3
… Cấu tạo
promoter nhóm II có bốn thành phần: Tâm promoter, trình tự UP (upstream
element), trình tự khởi đầu Inr, trình tự dowstream element (DE). Tâm promoter

1.2.4.1. Prompter cơ định
Promoter cơ định tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở hầu hết các
loại mô khác nhau trong nhiều giai đoạn phát triển của sinh vật. CaMV35S
promoter điều khiển sự biểu hiện của RNA 35S được phân lập từ virus khảm sp lơ
(cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình của loại promoter này.
Promoter này có cấu tạo gồm 3 bộ phận chính: Vùng trung tâm (hộp TATA có vị trí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
14
từ - 46 đến + 8) hai đoạn trình tự tăng cường (enhanor). Trong thời gian gần đây,
vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của
CaMV đã được nghiên cứu [44].
Trong hệ thống các promoter cơ định, promoter ubiquitin đóng một vai trò
hết sức quan trọng. Năm 1992, Christensen và cộng sự đã phát hiện ra 8 đến 10
locus mã hoá cho ubiquitin ở cây ngô. Cả hai gen đặc tính Ubi-1 và Ubi-2 đều chứa
một khung đọc mở bao gồm 1599 bp sắp xếp thành 7 chuỗi liên tiếp từ đầu đến cuối
với đoạn lặp lại có chiều dài 228 bp [22], [43]. Vùng điều chỉnh (regulatory region)
là vùng điều điều khiển quá trình biểu hiện gen Ubi-1 ở cây ngô là đoạn trình tự bắt
đầu từ vị trí -899 bp từ đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã đến vị trí 1093 bp đầu 3’
của vị trí khởi đầu phiên mã. Trình tự vùng điều chỉnh có kích thước khoảng 2 kb
bao gồm:
 Hộp TATA nằm ở vị trí -30 về đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã
 Hai đoạn trình tự trùng khớp (overlaping sequence) có liên quan đến các yếu
tố sốc nhiệt nằm ở vị trí -214 đến -204 so với vị trí khởi đầu phiên mã. Nhân
tố sốc nhiệt của vùng điều chỉnh làm tăng khả năng biểu hiện của ubiquitin
trong quá trình chống chịu lại với nhiệt độ
 Một đoạn trình tự exon không phiên mã có kích thước 83 bp nằm liền kề với
vị trí khởi đầu phiên mã
 Một đoạn trình tự intron kích thước khoảng 1 kb kéo dài từ vị trí +84 đến vị
trí +1093.


vùng cảm ứng ánh sáng là hộp G, hộp I, GT – 1 (hộp II)… Hộp G có trình tự đặc
trưng là CACGTG, hộp I có trình tự nhận biết là GATAAGR và trình tự ngược
chiều của nó – YCTATC cũng được ch ý đặc biệt. Đột biến xảy ra tại vùng này
làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của gen rbcS khi có ánh sáng [63].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn
16
1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật
Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen nói chung và
chuyển gen ở thực vật nói riêng. Việc chuyển nạp gen ở các giống cây có ý nghĩa
kinh tế thường rất khó vì vậy, cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gen chỉ
thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được dùng trong chuyển
gen thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả. Promoter 35S của virus
khảm CaMV hoặc FiMV và promoter NOS thường được sử dụng. Promoter 35S có
tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vetor chuyển gen.
Các promoter cảm ứng có vai trò đối với quá trình biểu hiện các gen chuyển
nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gen chống lại quá trình oxi hóa giúp
cho cây chống lại các stress hiếu khí hay các gen kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt
độ để chọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hoá các chất
dưới tác dụng của nhiệt. Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu
promoter sốc nóng [11], chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase
[12] và các promoter cảm ứng hormone [65].
Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ
thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gen và các chuỗi khởi động liên
quan được mô tả. Các gen này được thể hiện trong các loại mô hay trong các giai
đoạn phát triển khác nhau của cây như các gen thể hiện ở hạt phấn [9], ở hoa [59], ở
rễ [26] và ở thân [17].
Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn
các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polyubiquitin promoter được
phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô [22], cây thuốc lá [48], Arabitalic [19], cây
hướng dương [15], khoai tây [28], cà chua [50], lúa [55], [61], mía đường [64] và