Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ LUYỆN PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
THAI NGUYEN UNIVESSITY
THE COLLEGE OF EDUCATION SUMMARY OF MASTER ESSAY FOR EDUCATION SCIENCE
NGUYEN THI LUYEN
DEVELOPMENT OF REGENERATION ON MUNG BEAN
TOCHOOSE THE DROUGHT – RESISTANT STRAIN AND
TRANSGENATION Specialyty: GENETICS
Code: 60.42.70

Phản biện 1
…………………………………………… Phản biện 2
…………………………………………

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn
Họp tại: Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN

Ngày tháng năm 2009

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i



Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các
thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, và các chị Vi
Kiều Liên và Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), xin cảm
ơn Bộ môn hệ thống canh tác - Viện Ngô Trung ương đã cung cấp các giống
đậu xanh làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài.

Tác giả luận văn Nguyễn Thị Luyện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii
MỤC LỤC Trang


8
1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng……………………………………….
10
1.2.3. Phương thức chọn dòng………………………………………………. .
12
1.2.4. Tái sinh cây…………………………………………………………….
13
1.3. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng soma và hệ
thống tái sinh ở thực vật và cây đậu xanh
1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma……
1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh ………………

15
15
16
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu…………………………
18
2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………
18
2.1.1.Vật liệu thực vật………………………………………………………….
18
2.1.2. Hoá chất và thiết bị……………………………………………………
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv
2.2. Phương pháp nghiên cứu
19
2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro
20

34
35
3.1.3. Nhận xét về môi trường nuôi cấy mô cây đậu xanh……………………
37
3.2. Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh
các giống nghiên cứu …………………………………………………………

37
3.2.1.Mức độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh của các giống nghiên cứu
37
3.2.2. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô……………………………………………………………………….

39
3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng
thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu…………………………………

42
3.3. Kết quả tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầm
43
3.3.1.Môi trường nảy mầm của hạt……………………………………………
43
3.3.2. Môi trường tạo đa chồi…………………………………………………
43
3.3.3. Môi trường kéo dài chồi
45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v
3.3.4. Môi trường ra rễ
46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D
2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (Axit 2,4-Dichlorphenoxyacetic)
ADN
Axit deoxyribonucleic (Deoxiribonucleic acid)
ASTT
áp suất thẩm thấu
BAP
6 - Benzyl Amino Purin
cs
Cộng sự
đvms
đơn vị mô sẹo
MS
Murashige – Skoog
α-NAA
Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic)
IAA
Axit ß – indol axetic

3.4
Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ
mô sẹo phôi đậu xanh (%)
32
3.5
Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh
33
3.6
Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh
từ mô sẹo phôi đậu xanh
36
3.7
Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô (%)
38
3.8
Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô
1 tuần nuôi phục hồi
39
3.9
Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi
xử lý bằng thổi khô
41
3.10
Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh
44


phục hồi trên môi trường tái sinh

40
3.7
Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót
sau khi xử lý bằng thổi khô

41
3.8
Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô
42
3.9
Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), hạt đậu xanh được tách
ra để tạo đa chồi (C, D)

43
3.10
Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm
45
3.11
Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3
46
3.12
Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α- NAA
46
3.13
Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu.
47
nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu
Hoàng Mậu, 2001) [10] hoặc lai giống (Trần Đình Long và Lê Khả Tường,
1998) [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc. Một
trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn giống đậu xanh là sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen
nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu xanh (Jayanti Sen và
Spra Guha Mukherjee (1998) [31], Ignacimuthu và Franklin (1999) [30], Renato
và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [15], Sita và cs (2006)
[43], Kaviraj và cs (2006) [33], Sonia và cs (2007) [44].
Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn
thạc sĩ là: “Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.)
Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen”
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn dòng tế bào chịu
mất nước ở đậu xanh.
- Xác định hệ thống tái sinh ở đậu xanh phục vụ chuyển gen.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt sử dụng trong tái sinh cây từ mô sẹo và tạo
đa chồi từ mắt lá mầm.
- Phân tích ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô
sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo, kéo dài chồi, ra rễ và tạo cây đậu xanh.
- Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh dưới tác dụng của
thổi khô.
- Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ mắt lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ
và tạo cây hoàn chỉnh.

Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút. Hoa đậu xanh có
màu tím hoặc màu vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. Đậu xanh là
loài thực vật tự thụ phấn, tỷ lệ hoa hình thành quả từ 10 – 25%.Thụ phấn xong
tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển.
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 –
10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả.
Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen. Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu
xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông
dài khoảng 0,3 – 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm
vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, mầu trắng. Mỗi cây có từ 8 –
35 quả, mỗi quả có từ 8 – 15 hạt.
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh,
ovan, tròn, thoi, tam giác Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng),
xanh tối (nâu), vàng rơm Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối
lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu khoảng
20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng
sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ,
nhất là sát rễ cái hình thành các nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ
thường có kích thước 4 – 5 mm, có màu đỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng
que, ruột màu xanh hay đen đều không có hoạt tính. Hạn chế của bộ rễ cây đậu
xanh là dễ bị thối khi gặp úng.
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra củatrung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu
Á (AVRCD), hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh,
trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca được coi
là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh. Trong những

sinh trưởng của cây. Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất
thấp.
- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú
Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà
Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá. Đậu xanh ở vùng này được gieo
trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ
thu đông. Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ
thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này
cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn. Đây là những điều
kiện cơ bản trong phát triển sản xuất.
- Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên. Đây là vùng có diện tích và sản
lượng gieo trồng đậu xanh lớn. Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông
lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm. Hàng
năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ
yếu. Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa
bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng.
- Vùng Đông Nam bộ. Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26%
diện tích gieo trồng cả nước. Tuy nhiên, do không có thâm canh và việc sử dụng
các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn
thấp.
Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044,
VC2768A năng suất vụ hè thu khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây
thấp,cứng, chịu mưa và chống đổ tốt. ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng
đồng bằng và trung du Bắc bộ; V123 năng suất đạt 1800 – 2000 kg/ha, thâm
canh có thể đạt 2000 - 7000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ /năm; T135 năng suất đạt
2900 kg/ha trồng ở các tỉnh phía Bắc; V91-15 năng suất từ 1200 – 1400 kg/ha
cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhiều loại đất ở các tỉnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
phía Nam; HL-115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ha trồng vụ hè và 1400 – 2200

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở
thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này
được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng
sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ
trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất
định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết
sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
- Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học
thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có
tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác
động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Chính chức
năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng
cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết
được hoạt tính của auxin. Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4
Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (α – NAA),
Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá
trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, α – NAA có tác dụng
tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh
trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số cấc công trình nghiên cứu
chúng. Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo
từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ
60,8% [32]. Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu
xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là
100%. Ngoài sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh
ở đậu xanh …[34].
- Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von. Nó
tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như

loại thực vật cần thiết phải có nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho
việc chọn dòng. Sau đây là một số hệ thống nuôi cấy đã được thực hiện:
Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc
thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền
cao. Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như
thân, lá, rễ, hoa…trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin
và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường
nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định kì, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy
rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng
tái sinh của cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô.
Các tế bào di truyền có tính ổn định khá thấp. Nhiều tác giả đã thông báo
nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi nhiễm
sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác. Vì vậy việc nhân
nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận
trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất định chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái
sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính. Mặt khác những cây
tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa
trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong
phú hơn (Lê Trần Bình và cs 1997,1998) [1], [2]. Bằng cách này nhiều tác giả đã
thông báo thu được kết quả ở những giống cây trồng mới (Bertin và cs, 1995,
1997) [22], [23].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế bào
đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng. Các
tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi….
Muốn thu được tế bào huyền phù nhỏ, mịn cần phải sàng lọc liên tục qua các
loại sàng có mắt lọc nhỏ (<0,5 mm). Để đạt được dạng nuôi cấy huyền phù
tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian
cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2 – 3 tháng.